Химически компонент на серпентина от неръждаема стомана 304, структурата на ектодомена SPACA6 съдържа запазено суперсемейство от протеини, свързани със сливането на гамети.

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Плъзгачи, показващи три статии на слайд.Използвайте бутоните за връщане назад и напред, за да се движите през слайдовете, или бутоните за управление на плъзгачите в края, за да се движите през всеки слайд.

SPACA6 е повърхностен протеин, експресиран в сперматозоиди, който е критичен за сливането на гамети по време на сексуално възпроизвеждане на бозайници.Въпреки тази фундаментална роля, специфичната функция на SPACA6 е слабо разбрана.Ние изясняваме кристалната структура на извънклетъчния домен на SPACA6 при разделителна способност от 2, 2 Å, разкривайки двудоменен протеин, съставен от четириверижен пакет и Ig-подобни β-сандвичи, свързани с квази-гъвкави линкери.Тази структура прилича на IZUMO1, друг протеин, свързан със сливане на гамети, което прави SPACA6 и IZUMO1 членове-основатели на суперсемейството на протеини, свързани с оплождането, наричани тук суперсемейство IST.Суперсемейството IST е структурно дефинирано от неговия усукан сноп от четири спирали и двойка дисулфидно свързани CXXC мотиви.Базирано на структура AlphaFold търсене на човешкия протеом идентифицира допълнителни протеинови членове на това суперсемейство;по-специално, много от тези протеини участват в сливането на гамети.Структурата SPACA6 и нейната връзка с други членове на суперсемейството IST осигуряват липсващата връзка в познанията ни за сливането на гамети на бозайници.
Всеки човешки живот започва с две отделни хаплоидни гамети: спермата на бащата и яйцеклетката на майката.Тази сперма е победител в интензивен процес на селекция, по време на който милиони сперматозоиди преминават през женския генитален тракт, преодоляват различни препятствия1 и се подлагат на капацитет, което подобрява тяхната подвижност и процеса на повърхностни компоненти2,3,4.Дори ако спермата и яйцеклетката се намерят, процесът все още не е приключил.Ооцитът е заобиколен от слой кумулусни клетки и гликопротеинова бариера, наречена zona pellucida, през която сперматозоидите трябва да преминат, за да влязат в ооцита.Сперматозоидите използват комбинация от повърхностни адхезионни молекули и свързани с мембраната и секретирани ензими, за да преодолеят тези крайни бариери5.Тези молекули и ензими се съхраняват главно във вътрешната мембрана и акрозомалната матрица и се откриват, когато външната мембрана на спермата се лизира по време на акрозомалната реакция6.Последната стъпка в това интензивно пътуване е събитието на сливане на сперма-яйцеклетка, при което двете клетки сливат мембраните си, за да се превърнат в единичен диплоиден организъм7.Въпреки че този процес е новаторски в човешката репродукция, необходимите молекулярни взаимодействия са слабо разбрани.
В допълнение към оплождането на гамети, химията на сливането на два липидни двойни слоя е широко проучена.Като цяло мембранното сливане е енергийно неблагоприятен процес, който изисква протеинов катализатор да претърпи структурна конформационна промяна, която сближава две мембрани, нарушавайки тяхната непрекъснатост и причинявайки сливане 8,9.Тези протеинови катализатори са известни като фузогени и са открити в безброй системи за синтез.Те са необходими за навлизане на вируса в клетките-гостоприемници (напр. gp160 при HIV-1, пик при коронавируси, хемаглутинин при грипни вируси)10,11,12 плацента (синцитин)13,14,15 и сливания, образуващи гамети при нисши еукариоти ( HAP2/GCS1 в растения, протисти и членестоноги) 16,17,18,19.Fusogens за човешки гамети все още не са открити, въпреки че е доказано, че няколко протеина са критични за прикрепването и сливането на гамети.Експресираният в яйцеклетки CD9, трансмембранен протеин, необходим за сливането на миши и човешки гамети, беше първият открит 21,22,23.Въпреки че точната му функция остава неясна, ролята в адхезията, структурата на адхезионните фокуси върху яйчните микровили и/или правилното локализиране на повърхностните протеини на ооцитите изглежда вероятно 24,25,26.Двата най-типични протеина, които са критични за сливането на гамети, са сперматозоидният протеин IZUMO127 и протеинът на яйцеклетката JUNO28 и тяхното взаимно свързване е важна стъпка в разпознаването и адхезията на гаметите преди сливането.Мъжките Izumo1 нокаут мишки и женските Juno нокаут мишки са напълно стерилни, в тези модели сперматозоидите влизат в перивителинното пространство, но гаметите не се сливат.По подобен начин, сливането беше намалено, когато гаметите бяха третирани с анти-IZUMO1 или JUNO27,29 антитела в човешки експерименти за ин витро оплождане.
Наскоро беше открита новооткрита група протеини, експресирани в сперматозоиди, фенотипно подобни на IZUMO1 и JUNO20,30,31,32,33,34,35.Протеин 6, свързан с акрозомалната мембрана на сперматозоидите (SPACA6), е идентифициран като основен за оплождането в широкомащабно изследване за мутагенеза при мишки.Вмъкването на трансгена в гена Spaca6 произвежда нестопими сперматозоиди, въпреки че тези сперматозоиди инфилтрират перивителинното пространство 36 .Последващите нокаут изследвания при мишки потвърдиха, че Spaca6 е необходим за сливане на гамети 30,32.SPACA6 се експресира почти изключително в тестисите и има модел на локализация, подобен на този на IZUMO1, а именно в интимата на сперматозоидите преди акрозомалната реакция и след това мигрира към екваториалната област след акрозомалната реакция 30,32.Хомолози на Spaca6 съществуват в различни бозайници и други еукариоти 30 и значението им за сливането на човешки гамети е доказано чрез инхибиране на човешкото оплождане in vitro чрез резистентност към SPACA6 30.За разлика от IZUMO1 и JUNO, подробностите за структурата, взаимодействията и функцията на SPACA6 остават неясни.
За да разберем по-добре основния процес, лежащ в основата на сливането на човешка сперма и яйцеклетки, което ще ни позволи да информираме бъдещите разработки в семейното планиране и лечението на безплодието, ние проведохме структурни и биохимични изследвания SPACA6.Кристалната структура на извънклетъчния домен на SPACA6 показва четириспирален сноп (4HB) и подобен на имуноглобулин (Ig-подобен) домен, свързан с квази-гъвкави области.Както е предвидено в предишни проучвания,7,32,37 структурата на домейна на SPACA6 е подобна на тази на човешки IZUMO1 и двата протеина споделят необичаен мотив: 4HB с триъгълна спирална повърхност и двойка дисулфидно свързани CXXC мотиви.Ние предлагаме IZUMO1 и SPACA6 сега да дефинират по-голямо, структурно свързано суперсемейство от протеини, свързани със сливането на гамети.Използвайки функции, уникални за суперсемейството, ние проведохме изчерпателно търсене на структурния човешки протеом AlphaFold, идентифицирайки допълнителни членове на това суперсемейство, включително няколко члена, участващи в сливането на гамети и/или оплождането.Сега изглежда, че има обща структурна гънка и суперсемейство от протеини, свързани със сливането на гамети, и нашата структура предоставя молекулярна карта на този важен аспект от механизма на сливане на човешки гамети.
SPACA6 е трансмембранен протеин с едно преминаване с един N-свързан гликан и шест предполагаеми дисулфидни връзки (фигури S1a и S2).Експресирахме извънклетъчния домен на човешки SPACA6 (остатъци 27–246) в клетки на Drosophila S2 и пречистихме протеина, използвайки афинитет към никел, катионен обмен и хроматография за изключване на размера (фиг. S1b).Пречистеният SPACA6 ектодомен е много стабилен и хомогенен.Анализът, използващ хроматография за изключване на размера, комбинирана с полигонално разсейване на светлината (SEC-MALS), разкрива един пик с изчислено молекулно тегло от 26,2 ± 0,5 kDa (фиг. S1c).Това е в съответствие с размера на мономерния ектодомен SPACA6, което показва, че олигомеризацията не е настъпила по време на пречистването.В допълнение, спектроскопията с кръгов дихроизъм (CD) разкрива смесена α/β структура с точка на топене 51,3 °C (фиг. S1d,e).Деконволюцията на CD спектрите разкрива 38,6% α-спирални и 15,8% β-верижни елементи (Фигура S1d).
Ектодоменът SPACA6 беше кристализиран с помощта на произволно матрично засяване38, което доведе до набор от данни с разделителна способност от 2.2 Å (Таблица 1 и Фигура S3).Използвайки комбинация от молекулярно заместване на базата на фрагменти и данни за фазиране на SAD с излагане на бромид за определяне на структурата (Таблица 1 и Фигура S4), крайният прецизиран модел се състои от остатъци 27–246.По времето, когато структурата беше определена, нямаше налични експериментални или AlphaFold структури.Ектодоменът SPACA6 е с размери 20 Å × 20 Å × 85 Å, състои се от седем спирали и девет β-вериги и има удължена третична гънка, стабилизирана от шест дисулфидни връзки (фиг. 1a, b).Слабата електронна плътност в края на страничната верига на Asn243 показва, че този остатък е N-свързано гликозилиране.Структурата се състои от два домена: N-терминален сноп с четири спирали (4HB) и С-терминален Ig-подобен домен с междинна шарнирна област между тях (фиг. 1с).
a Структура на извънклетъчния домен на SPACA6.Лентова диаграма на извънклетъчния домен на SPACA6, цветът на веригата от N до C-края от тъмно синьо до тъмно червено.Цистеините, участващи в дисулфидните връзки, са подчертани в магента.b Топология на извънклетъчния домен на SPACA6.Използвайте същата цветова схема като на фигура 1а.c SPACA6 извънклетъчен домен.Диаграмите на 4HB, шарнирните и Ig-подобни домейни са оцветени съответно в оранжево, зелено и синьо.Слоевете не са начертани в мащаб.
Домейнът 4HB на SPACA6 включва четири основни спирали (спирали 1–4), които са подредени под формата на спирална спирала (Фиг. 2а), редуващи се между антипаралелни и паралелни взаимодействия (Фиг. 2b).Малка допълнителна спирала с едно завиване (спирала 1′) е положена перпендикулярно на снопа, образувайки триъгълник със спирали 1 и 2. Този триъгълник е леко деформиран в спираловидно усуканата опаковка на относително плътната опаковка на спирали 3 и 4 ( Фиг. 2а).
4HB N-терминална диаграма.b Изглед отгоре на пакет от четири спирали, всяка спирала е подчертана в тъмно синьо на N-края и тъмночервена на C-края.c Диаграма на спираловидно колело отгоре надолу за 4HB, като всеки остатък е показан като кръг, обозначен с еднобуквен код на аминокиселина;само четирите аминокиселини в горната част на колелото са номерирани.Неполярните остатъци са оцветени в жълто, полярните незаредени остатъци са оцветени в зелено, положително заредените остатъци са оцветени в синьо, а отрицателно заредените остатъци са оцветени в червено.d Триъгълни лица на домейна 4HB, с 4HB в оранжево и панти в зелено.И двете вложки показват пръчковидни дисулфидни връзки.
4HB е концентриран върху вътрешно хидрофобно ядро, съставено главно от алифатни и ароматни остатъци (фиг. 2с).Ядрото съдържа дисулфидна връзка между Cys41 и Cys55, която свързва спирали 1 и 2 заедно в горен повдигнат триъгълник (фиг. 2d).Две допълнителни дисулфидни връзки бяха образувани между CXXC мотива в Helix 1' и друг CXXC мотив, намерен на върха на β-фибичката в шарнирната област (фиг. 2d).Консервативен аргининов остатък с неизвестна функция (Arg37) се намира вътре в кух триъгълник, образуван от спирали 1', 1 и 2. Алифатните въглеродни атоми Cβ, Cγ и Cδ Arg37 взаимодействат с хидрофобното ядро ​​и неговите гуанидинови групи се движат циклично между спирали 1' и 1 чрез взаимодействия между гръбнака на Thr32 и страничната верига (фиг. S5a, b).Tyr34 се простира в кухината, оставяйки две малки кухини, през които Arg37 може да взаимодейства с разтворителя.
Ig-подобните β-сандвич домени са голямо суперсемейство от протеини, които споделят общата характеристика на два или повече многоверижни амфипатични β-листа, взаимодействащи чрез хидрофобно ядро ​​39. С-терминалният Ig-подобен домен на SPACA6 има същия модел и се състои от два слоя (фиг. S6a).Лист 1 е β-лист от четири нишки (нишки D, F, H и I), където нишките F, H и I образуват антипаралелна подредба, а нишките I и D приемат паралелно взаимодействие.Таблица 2 е малък антипаралелен двуверижен бета лист (нишки E и G).Наблюдава се вътрешна дисулфидна връзка между С-края на Е веригата и центъра на Н веригата (Cys170-Cys226) (Фиг. S6b).Тази дисулфидна връзка е аналогична на дисулфидната връзка в β-сандвич домена на имуноглобулина40,41.
Четиринишковият β-лист се усуква по цялата си дължина, образувайки асиметрични ръбове, които се различават по форма и електростатика.По-тънкият ръб е плоска хидрофобна повърхност на околната среда, която се откроява в сравнение с останалите неравни и електростатично различни повърхности в SPACA6 (фиг. S6b, c).Ореол от открити гръбначни карбонилни/амино групи и полярни странични вериги заобикаля хидрофобната повърхност (фиг. S6c).По-широкият ръб е покрит от спирален сегмент с капачка, който блокира N-терминалната част на хидрофобното ядро ​​и образува три водородни връзки с отворената полярна група на гръбнака на F веригата (фиг. S6d).С-терминалната част на този ръб образува голям джоб с частично изложено хидрофобно ядро.Джобът е заобиколен от положителни заряди, дължащи се на три комплекта двойни аргининови остатъци (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 и Arg212-Arg214) и централен хистидин (His220) (Фигура S6e).
Шарнирната област е къс сегмент между спиралния домен и Ig-подобния домен, състоящ се от един антипаралелен триверижен β-слой (нишки A, B и C), малка 310 спирала и няколко дълги произволни спирални сегмента.(Фиг. S7).Мрежа от ковалентни и електростатични контакти в областта на шарнира изглежда стабилизира ориентацията между 4HB и Ig-подобния домен.Мрежата може да бъде разделена на три части.Първата част включва два CXXC мотива (27CXXC30 и 139CXXC142), които образуват двойка дисулфидни връзки между β-фибичката в пантата и 1' спиралата в 4HB.Втората част включва електростатични взаимодействия между Ig-подобния домен и пантата.Glu132 в шарнира образува солев мост с Arg233 в Ig-подобния домен и Arg135 в шарнира.Третата част включва ковалентна връзка между Ig-подобния домен и шарнирната област.Две дисулфидни връзки (Cys124-Cys147 и Cys128-Cys153) свързват шарнирната верига към линкер, който е стабилизиран чрез електростатични взаимодействия между Gln131 и основната функционална група, позволявайки достъп до първия Ig-подобен домейн.верига.
Структурата на SPACA6 ектодомейна и индивидуалните структури на 4HB и Ig-подобни домейни бяха използвани за търсене на структурно подобни записи в протеинови бази данни 42 .Ние идентифицирахме съвпадения с високи резултати на Dali Z, малки стандартни отклонения и големи LALI резултати (последните са броят на структурно еквивалентните остатъци).Докато първите 10 попадения от пълното търсене на ектодомейн (Таблица S1) имаха приемлив Z-резултат от >842, търсене само на 4HB или Ig-подобен домейн показа, че повечето от тези попадения съответстват само на β-сандвичи.повсеместна гънка, открита в много протеини.И трите търсения в Dali върнаха само един резултат: IZUMO1.
Отдавна се предполага, че SPACA6 и IZUMO1 споделят структурни прилики7,32,37.Въпреки че ектодомените на тези два протеина, свързани със сливане на гамети, споделят само 21% идентичност на последователността (Фигура S8a), сложни доказателства, включително запазен модел на дисулфидна връзка и предсказан С-терминален Ig-подобен домен в SPACA6, позволиха ранни опити за изграждане на хомологичен модел на A мишка SPACA6, използвайки IZUMO1 като шаблон37.Нашата структура потвърждава тези прогнози и показва истинската степен на сходство.Всъщност структурите SPACA6 и IZUMO137,43,44 споделят една и съща двудомейнова архитектура (Фиг. S8b) с подобни 4HB и Ig-подобни β-сандвич домейни, свързани с шарнирна област (Фиг. S8c).
IZUMO1 и SPACA6 4HB имат общи разлики от конвенционалните спирални снопове.Типични 4HBs, като тези, открити в SNARE протеинови комплекси, участващи в ендозомално сливане 45, 46, имат равномерно разположени спирали, поддържащи постоянна кривина около централна ос 47. За разлика от това, спиралните домейни както в IZUMO1, така и в SPACA6 бяха изкривени, с променлива кривина и неравномерно опаковане (Фигура S8d).Усукването, вероятно причинено от триъгълника, образуван от спирали 1', 1 и 2, се запазва в IZUMO1 и SPACA6 и се стабилизира от същия CXXC мотив върху спирала 1'.Въпреки това, допълнителната дисулфидна връзка, открита в SPACA6 (Cys41 и Cys55 ковалентно свързващи спирали 1 и 2 по-горе) създава по-остър връх на върха на триъгълника, което прави SPACA6 по-усукан от IZUMO1, с по-изразени триъгълници с кухини.В допълнение, IZUMO1 няма Arg37, наблюдаван в центъра на тази кухина в SPACA6.За разлика от това, IZUMO1 има по-типично хидрофобно ядро ​​от алифатни и ароматни остатъци.
IZUMO1 има Ig-подобен домен, състоящ се от двуверижен и петверижен β-лист43.Допълнителната нишка в IZUMO1 замества намотката в SPACA6, която взаимодейства с нишката F, за да ограничи основните водородни връзки в нишката.Интересна точка за сравнение е предвиденият повърхностен заряд на Ig-подобните домени на двата протеина.Повърхността IZUMO1 е по-отрицателно заредена от повърхността SPACA6.Допълнителен заряд се намира близо до С-края, обърнат към мембраната на спермата.В SPACA6 същите региони бяха по-неутрални или положително заредени (фиг. S8e).Например, хидрофобната повърхност (по-тънки ръбове) и положително заредените ями (по-широки ръбове) в SPACA6 са отрицателно заредени в IZUMO1.
Въпреки че връзката и елементите на вторичната структура между IZUMO1 и SPACA6 са добре запазени, структурното подреждане на Ig-подобните домени показа, че двата домена се различават в общата си ориентация един спрямо друг (фиг. S9).Спиралният сноп на IZUMO1 е извит около β-сандвича, създавайки описаната по-горе форма на "бумеранг" на около 50 ° от централната ос.За разлика от това, спиралният лъч в SPACA6 беше наклонен на около 10 ° в обратната посока.Разликите в тези ориентации вероятно се дължат на разликите в областта на шарнира.На първично ниво на последователност, IZUMO1 и SPACA6 споделят малко сходство на последователността в пантата, с изключение на остатъците от цистеин, глицин и аспарагинова киселина.В резултат на това водородните връзки и електростатичните мрежи са напълно различни.Елементите на вторичната структура на β-лист се споделят от IZUMO1 и SPACA6, въпреки че веригите в IZUMO1 са много по-дълги и спиралата 310 (спирала 5) е уникална за SPACA6.Тези разлики водят до различни ориентации на домейна за два иначе подобни протеина.
Нашето търсене на сървър на Dali разкри, че SPACA6 и IZUMO1 са единствените две експериментално определени структури, съхранявани в базата данни на протеини, които имат тази конкретна 4HB гънка (Таблица S1).Съвсем наскоро DeepMind (Alphabet/Google) разработи AlphaFold, система, базирана на невронни мрежи, която може точно да предвиди 3D структурите на протеини от първични последователности48.Малко след като решихме структурата SPACA6, беше пусната базата данни AlphaFold, предоставяща предсказуеми структурни модели, покриващи 98,5% от всички протеини в човешкия протеом48,49.Използвайки нашата разрешена структура SPACA6 като модел за търсене, търсенето на структурна хомология за модела в човешкия протеом AlphaFold идентифицира кандидати с възможни структурни прилики със SPACA6 и IZUMO1.Като се има предвид невероятната точност на AlphaFold при прогнозиране на SPACA6 (Фиг. S10a) - особено 1.1 Å rms ектодомейн в сравнение с нашата разрешена структура (Фиг. S10b) - можем да бъдем уверени, че идентифицираните съвпадения на SPACA6 вероятно ще бъдат точни.
Преди това PSI-BLAST търсеше клъстера IZUMO1 с три други протеина, свързани със спермата: IZUMO2, IZUMO3 и IZUMO450.AlphaFold прогнозира, че тези протеини от семейство IZUMO се сгъват в 4HB домейна със същия модел на дисулфидна връзка като IZUMO1 (Фигури 3a и S11), въпреки че им липсва Ig-подобен домейн.Хипотезата е, че IZUMO2 и IZUMO3 са едностранни мембранни протеини, подобни на IZUMO1, докато IZUMO4 изглежда се секретира.Функциите на протеините IZUMO 2, 3 и 4 при сливането на гамети не са определени.Известно е, че IZUMO3 играе роля в биогенезата на акрозомата по време на развитието на спермата51 и е установено, че протеинът IZUMO образува комплекс50.Запазването на протеини IZUMO при бозайници, влечуги и земноводни предполага, че тяхната потенциална функция е в съответствие с тази на други известни протеини, свързани със сливане на гамети, като DCST1/2, SOF1 и FIMP.
Диаграма на архитектурата на домейна на суперсемейството IST, с 4HB, шарнирни и Ig-подобни домейни, подчертани съответно в оранжево, зелено и синьо.IZUMO4 има уникален С-терминален регион, който изглежда черен.Потвърдените и предполагаемите дисулфидни връзки са показани съответно с плътни и пунктирани линии.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) и TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) се показват в същия цветови диапазон като панел A. Дисулфидните връзки са показани в магента.Трансмембранните спирали TMEM95, IZUMO2 и IZUMO3 не са показани.
За разлика от протеина IZUMO, други протеини SPACA (т.е. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 и SPACA9) се смятат за структурно различни от SPACA6 (фиг. S12).Само SPACA9 има 4HB, но не се очаква да има същата паралелно-анти-паралелна ориентация или същата дисулфидна връзка като SPACA6.Само SPACA1 има подобен Ig-подобен домен.AlphaFold прогнозира, че SPACA3, SPACA4 и SPACA5 имат напълно различна структура от SPACA6.Интересно е, че SPACA4 също е известно, че играе роля в оплождането, но в по-голяма степен от SPACA6, вместо това улеснявайки взаимодействието между сперматозоидите и яйцеклетката zona pellucida52.
Нашето търсене в AlphaFold намери друго съвпадение за IZUMO1 и SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, единичен специфичен за спермата трансмембранен протеин, прави мъжки мишки безплодни, когато се аблира 32,33.Сперматозоидите без TMEM95 имаха нормална морфология, подвижност и способността да проникнат през zona pellucida и да се свържат с мембраната на яйцеклетката, но не можеха да се слеят с мембраната на ооцита.Предишни проучвания показват, че TMEM95 споделя структурни прилики с IZUMO133.Наистина, моделът AlphaFold потвърди, че TMEM95 е 4HB със същата двойка CXXC мотиви като IZUMO1 и SPACA6 и същата допълнителна дисулфидна връзка между спирали 1 и 2, открити в SPACA6 (фиг. 3a и S11).Въпреки че на TMEM95 липсва Ig-подобен домен, той има регион с модел на дисулфидна връзка, подобен на шарнирните региони SPACA6 и IZUMO1 (фиг. 3b).По време на публикуването на този ръкопис сървърът за предпечат докладва структурата на TMEM95, потвърждавайки резултата AlphaFold53.TMEM95 е много подобен на SPACA6 и IZUMO1 и е еволюционно запазен вече при земноводните (фиг. 4 и S13).
Търсенето на PSI-BLAST използва базите данни NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP и SOF1, за да определи позицията на тези последователности в дървото на живота.Разстоянията между точките на разклонение не са показани в мащаб.
Поразителното цялостно структурно сходство между SPACA6 и IZUMO1 предполага, че те са основатели на запазено структурно суперсемейство, което включва TMEM95 и IZUMO 2, 3 и 4 протеини.известни членове: IZUMO1, SPACA6 и TMEM95.Тъй като само няколко члена притежават Ig-подобни домейни, отличителният белег на суперсемейството IST е домейнът 4HB, който има уникални характеристики, общи за всички тези протеини: 1) Навит 4HB със спирали, подредени в анти-паралелно/паралелно редуване (фиг. 5a), 2) снопът има триъгълно лице, състоящо се от две спирали в снопа и трета вертикална спирала (фиг. ключова област (фиг. 5c). Известно е, че CXXC мотивът, открит в тиоредоксин-подобни протеини, функционира като редокс сензор 54,55,56, докато мотивът в членовете на семейството на IST може да бъде свързан с протеинови дисулфидни изомерази като ERp57 при сливане на гамети Ролите са свързани 57,58.
Членовете на суперсемейството IST се определят от три характерни черти на 4HB домейна: четири спирали, редуващи се между паралелна и антипаралелна ориентация, ba-триъгълни спирални снопчета и ca CXXC двоен мотив, образуван между малки молекули.) N-терминални спирали (оранжево) и шарнирна област β-шнола (зелено).
Като се има предвид сходството между SPACA6 и IZUMO1, беше тествана способността на първия да се свързва с IZUMO1 или JUNO.Интерферометрията на биослоя (BLI) е кинетично базиран метод на свързване, който преди това е бил използван за количествено определяне на взаимодействието между IZUMO1 и JUNO.След инкубиране на белязания с биотин сензор с IZUMO1 като примамка с висока концентрация на JUNO аналит, беше открит силен сигнал (фиг. S14a), показващ индуцирана от свързване промяна в дебелината на биоматериала, прикрепен към върха на сензора.Подобни сигнали (т.е. JUNO, свързан към сензора като примамка срещу аналита IZUMO1) (фиг. S14b).Не беше открит сигнал, когато SPACA6 беше използван като аналит срещу свързан със сензор IZUMO1 или свързан със сензор JUNO (Фигура S14a, b).Липсата на този сигнал показва, че извънклетъчният домен на SPACA6 не взаимодейства с извънклетъчния домен на IZUMO1 или JUNO.
Тъй като BLI анализът се основава на биотинилиране на свободни лизинови остатъци върху протеина на стръвта, тази модификация може да предотврати свързването, ако лизиновите остатъци са включени във взаимодействието.В допълнение, ориентацията на свързването по отношение на сензора може да създаде пространствени пречки, така че конвенционалните анализи на изтегляне също бяха извършени върху рекомбинантните SPACA6, IZUMO1 и JUNO ектодомени.Въпреки това, SPACA6 не се утаява с His-маркиран IZUMO1 или His-маркиран JUNO (фиг. S14c, d), което показва, че няма взаимодействие, съответстващо на това, наблюдавано в BLI експерименти.Като положителна контрола потвърдихме взаимодействието на JUNO с белязан His IZUMO1 (фигури S14e и S15).
Въпреки структурното сходство между SPACA6 и IZUMO1, неспособността на SPACA6 да свърже JUNO не е изненадваща.Повърхността на човешкия IZUMO1 има повече от 20 остатъка, които взаимодействат с JUNO, включително остатъци от всеки от трите региона (въпреки че повечето от тях са разположени в шарнирния регион) (фиг. S14f).От тези остатъци само един е запазен в SPACA6 (Glu70).Докато много замествания на остатъци запазиха първоначалните си биохимични свойства, основният остатък Arg160 в IZUMO1 беше заменен от отрицателно заредения Asp148 в SPACA6;предишни проучвания показват, че мутацията Arg160Glu в IZUMO1 почти напълно премахва свързването с JUNO43.В допълнение, разликата в ориентацията на домейна между IZUMO1 и SPACA6 значително увеличи повърхностната площ на JUNO-свързващото място на еквивалентния регион на SPACA6 (фиг. S14g).
Въпреки известната нужда от SPACA6 за сливане на гамети и сходството му с IZUMO1, SPACA6 не изглежда да има еквивалентна JUNO свързваща функция.Затова се опитахме да комбинираме нашите структурни данни с доказателства за важност, предоставени от еволюционната биология.Подравняването на последователността на хомолозите на SPACA6 показва запазването на общата структура извън бозайниците.Например, цистеинови остатъци присъстват дори в далечно свързани земноводни (фиг. 6а).Използвайки сървъра ConSurf, данните за задържане на множество последователности от 66 последователности бяха нанесени на повърхността на SPACA6.Този тип анализ може да покаже кои остатъци са били запазени по време на еволюцията на протеина и може да посочи кои повърхностни региони играят роля във функцията.
Подравняване на последователност на SPACA6 ектодомени от 12 различни вида, приготвени с помощта на CLUSTAL OMEGA.Според анализа на ConSurf най-консервативните позиции са маркирани в синьо.Остатъците от цистеин са подчертани в червено.Границите на домейна и елементите на вторичната структура са показани в горната част на подравняването, където стрелките показват β-вериги, а вълните показват спирали.Идентификаторите за достъп на NCBI, съдържащи последователностите, са: човек (Homo sapiens, NP_001303901), мандрил (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), маймуна капуцин (Cebus mimic, XP_017359366), кон (Equus caballus, XP_023506102), косатка (Orc inus orca3_23 XP_032_034) .), овца (Ovis aries, XP_014955560), слон (Loxodonta africana, XP_010585293), куче (Canis lupus familyis, XP_025277208), мишка (Mus musculus, NP_001156381), тасманийски дявол (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0 318), птицечовка, 8) , 61_89 и Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Номерирането се основава на човешки ред.b Повърхностно представяне на структурата SPACA6 с 4HB в горната част и Ig-подобен домейн в долната част, цветове въз основа на оценки за опазване от сървъра ConSurf.Най-добре запазените части са в синьо, средно запазените са в бяло, а най-слабо запазените са в жълто.лилав цистеин.Три повърхностни лепенки, демонстриращи високо ниво на защита, са показани във вмъкването, означено с лепенки 1, 2 и 3. Карикатура 4HB е показана във вмъкването горе вдясно (същата цветова схема).
Структурата SPACA6 има три силно запазени повърхностни области (фиг. 6b).Кръпка 1 обхваща 4HB и шарнирната област и съдържа два запазени CXXC дисулфидни моста, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 шарнирна мрежа (фиг. S7) и три запазени външни ароматни остатъка (Phe31, Tyr73, Phe137)).по-широк ръб на Ig-подобния домен (фиг. S6e), който представлява няколко положително заредени остатъка върху повърхността на спермата.Интересното е, че този пластир съдържа епитоп на антитяло, за който преди това е доказано, че пречи на функцията на SPACA6 30.Регион 3 обхваща шарнира и едната страна на Ig-подобния домен;този регион съдържа запазени пролини (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) и обърнати навън полярни/заредени остатъци.Изненадващо, повечето от остатъците на повърхността на 4HB са силно променливи (фиг. 6b), въпреки че гънката се запазва в целия SPACA6 хомолог (както е посочено от консерватизма на ядрото на хидрофобния сноп) и извън суперсемейството IST.
Въпреки че това е най-малкият регион в SPACA6 с най-малко откриваеми вторични структурни елементи, много остатъци от шарнирен регион (включително регион 3) са силно запазени сред хомолозите на SPACA6, което може да показва, че ориентацията на спиралния сноп и β-сандвич играе роля.като консерватор.Въпреки това, въпреки обширните водородни връзки и електростатичните мрежи в шарнирната област на SPACA6 и IZUMO1, доказателства за присъща гъвкавост могат да се видят в подравняването на множеството разрешени структури на IZUMO137,43,44.Подравняването на отделните домейни се припокрива добре, но ориентацията на домейните един спрямо друг варира от 50 ° до 70 ° от централната ос (фиг. S16).За да се разбере конформационната динамика на SPACA6 в разтвор, бяха проведени SAXS експерименти (фиг. S17a, b).Ab initio реконструкцията на ектодомейна SPACA6 съответства на пръчкова кристална структура (фиг. S18), въпреки че графиката на Kratky показва известна степен на гъвкавост (фиг. S17b).Тази конформация контрастира с IZUMO1, при който несвързаният протеин приема форма на бумеранг както в решетката, така и в разтвора43.
За специфично идентифициране на гъвкавия регион беше извършена масова спектроскопия с обмен на водород-деутерий (H-DXMS) на SPACA6 и сравнена с данни, получени преди това на IZUMO143 (фиг. 7a, b).SPACA6 е очевидно по-гъвкав от IZUMO1, както се вижда от по-високия обмен на деутерий в цялата структура след 100 000 s обмен.И в двете структури С-терминалната част на шарнирната област показва високо ниво на обмен, което вероятно позволява ограничено въртене на 4HB и Ig-подобни домени един спрямо друг.Интересното е, че C-терминалната част на шарнира SPACA6, състояща се от остатъка 147CDLPLDCP154, е силно запазена област 3 (Фиг. 6b), което вероятно показва, че гъвкавостта на междудомейните е еволюционно запазена характеристика на SPACA6.Според анализа на гъвкавостта, данните за термично топене на CD показват, че SPACA6 (Tm = 51.2°C) е по-малко стабилен от IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (фиг. S1e и S19).
a H-DXMS изображения на SPACA6 и b IZUMO1.Процентният обмен на деутерий се определя в посочените времеви точки.Нивата на обмен водород-деутерий са обозначени с цвят върху градиентна скала от синьо (10%) до червено (90%).Черните кутии представляват области с висок обмен.Границите на 4HB, шарнира и Ig-подобния домен, наблюдавани в кристалната структура, са показани над първичната последователност.Нивата на обмен на деутерий при 10 s, 1000 s и 100 000 s бяха нанесени върху лентова диаграма, насложена върху прозрачните молекулни повърхности на SPACA6 и IZUMO1.Части от структури с ниво на обмен на деутерий под 50% са оцветени в бяло.Областите над 50% H-DXMS обмен са оцветени в градиентна скала.
Използването на CRISPR/Cas9 и генетични стратегии за нокаут на миши ген доведе до идентифицирането на няколко фактора, важни за свързването и сливането на сперматозоидите и яйцеклетките.Освен добре характеризираното взаимодействие на структурата IZUMO1-JUNO и CD9, повечето от протеините, свързани със сливането на гамети, остават структурно и функционално загадъчни.Биофизичната и структурна характеристика на SPACA6 е друга част от молекулярния пъзел на адхезията/сливането по време на оплождането.
SPACA6 и други членове на суперсемейството IST изглежда са силно запазени при бозайници, както и при отделни птици, влечуги и земноводни;всъщност се смята, че SPACA6 дори е необходим за оплождане при рибка зебра 59. Това разпределение е подобно на други известни протеини, свързани със сливане на гамети, като DCST134, DCST234, FIMP31 и SOF132, което предполага, че тези фактори са с дефицит на HAP2 (също известни като GCS1) протеини, които са отговорни за каталитичната активност на много протисти., растения и членестоноги.Оплодени слети протеини 60, 61. Въпреки силното структурно сходство между SPACA6 и IZUMO1, нокаутът на гени, кодиращи някой от тези протеини, доведе до безплодие при мъжки мишки, което показва, че техните функции в сливането на гамети не се дублират..По-общо казано, нито един от известните сперматозоидни протеини, необходими за адхезионната фаза на сливането, не е излишен.
Остава открит въпросът дали SPACA6 (и други членове на суперсемейството IST) участват в междугаметични връзки, формират интрагаметични мрежи за набиране на важни протеини към точки на сливане или може би дори действат като неуловими фузогени.Изследвания на коимунопреципитация в клетки HEK293T разкриха взаимодействие между IZUMO1 с пълна дължина и SPACA632.Въпреки това, нашите рекомбинантни ектодомени не взаимодействат in vitro, което предполага, че взаимодействията, наблюдавани в Noda et al.и двете бяха изтрити в конструкцията (обърнете внимание на цитоплазмената опашка на IZUMO1, за която е доказано, че не е необходима за оплождане62).Алтернативно, IZUMO1 и/или SPACA6 може да изискват специфични среди на свързване, които ние не възпроизвеждаме in vitro, като физиологично специфични конформации или молекулярни комплекси, съдържащи други протеини (известни или все още неоткрити).Въпреки че се смята, че ектодомейнът IZUMO1 медиира прикрепването на сперматозоидите към яйцеклетката в перивителинното пространство, целта на ектодомена SPACA6 е неясна.
Структурата на SPACA6 разкрива няколко запазени повърхности, които могат да бъдат включени в протеин-протеинови взаимодействия.Запазената част от шарнирната област, непосредствено съседна на мотива CXXC (означена като кръпка 1 по-горе), има няколко обърнати навън ароматни остатъци, които често се свързват с хидрофобни и π-подреждащи взаимодействия между биомолекулите.Широките страни на Ig-подобния домен (област 2) образуват положително заредена бразда с високо запазени Arg и His остатъци и антитела срещу тази област преди това са били използвани за блокиране на сливането на гамети 30 .Антитялото разпознава линейния епитоп 212RIRPAQLTHRGTFS225, който има три от шестте аргининови остатъка и силно запазен His220.Не е ясно дали дисфункцията се дължи на блокиране на тези специфични остатъци или на целия регион.Местоположението на тази празнина близо до С-края на β-сандвича показва цис-взаимодействия със съседни протеини на спермата, но не и с протеини на яйцеклетки.Освен това, задържането на силно гъвкава богата на пролин плетеница (място 3) в рамките на пантата може да бъде мястото на взаимодействие протеин-протеин или, по-вероятно, да показва запазването на гъвкавостта между двата домена.Полът е важен за неизвестната роля на SPACA6.сливане на гамети.
SPACA6 има свойства на междуклетъчни адхезионни протеини, включително Ig-подобни β-сандвичи.Много адхезивни протеини (напр. кадхерини, интегрини, адхезини и IZUMO1) притежават един или повече β-сандвич домени, които разширяват протеините от клетъчната мембрана до техните мишени в околната среда63,64,65.Ig-подобният домейн на SPACA6 също съдържа мотив, често срещан в β-сандвичи на адхезия и кохезия: дублети от успоредни нишки в краищата на β-сандвичи, известни като механични скоби66.Смята се, че този мотив повишава устойчивостта на срязващи сили, което е ценно за протеините, участващи в междуклетъчните взаимодействия.Въпреки това, въпреки това сходство с адхезините, понастоящем няма доказателства, че SPACA6 взаимодейства с яйчен белтък.Ектодоменът SPACA6 не е в състояние да се свърже с JUNO и SPACA6-експресиращи HEK293T клетки, както е показано тук, почти не взаимодействат с ооцити без зона 32.Ако SPACA6 установи интергаметични връзки, тези взаимодействия може да изискват пост-транслационни модификации или да бъдат стабилизирани от други сперматозоидни протеини.В подкрепа на последната хипотеза, IZUMO1-дефицитните сперматозоиди се свързват с ооцити, демонстрирайки, че молекули, различни от IZUMO1, участват в етапа на адхезия на гамети 27.
Много вирусни, клетъчни и слети протеини на развитието имат свойства, които предсказват тяхната функция като фузогени.Например, вирусните слети гликопротеини (класове I, II и III) имат хидрофобен слят пептид или бримка в края на протеина, който се вмъква в мембраната на гостоприемника.Картата на хидрофилността на IZUMO143 и структурата (определена и прогнозирана) на суперсемейството IST не показват видим хидрофобен слят пептид.По този начин, ако някои протеини в суперсемейството IST функционират като фузогени, те го правят по начин, различен от други известни примери.
В заключение, функциите на членовете на суперсемейството IST от протеини, свързани със сливането на гамети, остават мъчителна мистерия.Нашата характеризирана рекомбинантна молекула SPACA6 и нейната разрешена структура ще осигурят представа за връзките между тези споделени структури и тяхната роля в прикрепването и сливането на гамети.
ДНК последователността, съответстваща на предсказания човешки SPACA6 ектодомейн (NCBI номер за достъп NP_001303901.1; остатъци 27–246) е оптимизирана за кодон за експресия в Drosophila melanogaster S2 клетки и се синтезира като генен фрагмент с последователността, кодираща Kozak (Eurofins Genomics)., сигналът за секреция на BiP и съответните 5' и 3' краища за независимо от лигиране клониране на този ген в pMT експресионен вектор на базата на металотионеинов промотор, модифициран за селекция с пуромицин (pMT-puro).Векторът pMT-puro кодира място на разцепване на тромбин, последвано от 10x-His С-терминален маркер (Фигура S2).
Стабилна трансфекция на SPACA6 pMT-puro вектор в D. melanogaster S2 (Gibco) клетки се извършва подобно на протокола, използван за IZUMO1 и JUNO43.S2 клетките се размразяват и се отглеждат в среда на Schneider (Gibco), допълнена с крайна концентрация от 10% (v/v) топлинно инактивиран фетален телешки серум (Gibco) и 1X антимикотичен антибиотик (Gibco).Клетки за ранен пасаж (3.0 х 106 клетки) се посяват в отделни ямки на 6-ямкови плаки (Corning).След 24 часа инкубация при 27°С, клетките се трансфектират със смес от 2 mg от вектора SPACA6 pMT-puro и реагент за трансфекция Effectene (Qiagen) съгласно протокола на производителя.Трансфектираните клетки се инкубират в продължение на 72 часа и след това се събират с 6 mg/ml пуромицин.След това клетките се изолират от пълната среда на Schneider и се поставят в свободна от серум среда Insect-XPRESS (Lonza) за широкомащабно производство на протеин.1 L партида от S2 клетъчна култура се отглежда до 8–10 × 106 ml-1 клетки в 2 L вентилирана полипропиленова ерленмайерова колба с плоско дъно и след това се стерилизира с крайна концентрация от 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) и се филтрува стерилно.индуциран.Индуцираните култури се инкубират при 27°С при 120 rpm в продължение на четири дни.
Кондиционирана среда, съдържаща SPACA6, се изолира чрез центрофугиране при 5660 × g при 4 ° С, последвано от система за филтриране на тангенциален поток Centramate (Pall Corp) с 10 kDa MWCO мембрана.Нанесете концентрирана среда, съдържаща SPACA6, в колона с 2 ml Ni-NTA агарозна смола (Qiagen).Ni-NTA смолата се промива с 10 колонни обема (CV) буфер А и след това се добавя 1 CV буфер А, за да се получи крайна концентрация на имидазол от 50 тМ.SPACA6 се елуира с 10 ml буфер А, допълнен с имидазол до крайна концентрация от 500 тМ.Тромбин от рестрикционен клас (Millipore Sigma) се добавя директно към диализната тръба (MWCO 12-14 kDa) при 1 единица на mg SPACA6 срещу 1 L 10 mM Tris-HCl, рН 7,5 и 150 mM NaCl (буфер В) за диализа.) при 4°C за 48 часа.Разцепеният от тромбин SPACA6 след това се разрежда трикратно, за да се намали концентрацията на сол и се зарежда в 1 ml MonoS 5/50 GL катионобменна колона (Cytiva/GE), уравновесена с 10 mM Tris-HCl, рН 7.5.Катионният обменник се промива с 3 CV от 10 mM Tris-HCl, рН 7.5, след което SPACA6 се елуира с линеен градиент от 0 до 500 mM NaCl в 10 mM Tris-HCl, рН 7.5 за 25 CV.След йонообменна хроматография, SPACA6 се концентрира до 1 ml и се елуира изократно от колона ENrich SEC650 10 х 300 (BioRad), уравновесена с буфер В. Съгласно хроматограмата, обединете и концентрирайте фракциите, съдържащи SPACA6.Чистотата се контролира чрез оцветена с Coomassie електрофореза върху 16% SDS-полиакриламиден гел.Концентрацията на протеин се определя количествено чрез абсорбция при 280 nm, като се използва закона на Beer-Lambert и теоретичния моларен коефициент на екстинкция.
Пречистеният SPACA6 се диализира за една нощ срещу 10 mM натриев фосфат, рН 7,4 и 150 mM NaF и се разрежда до 0,16 mg/mL преди анализ чрез CD спектроскопия.Спектралното сканиране на CD с дължина на вълната от 185 до 260 nm беше събрано на спектрополяриметър Jasco J-1500, използвайки кварцови кювети с дължина на оптичния път 1 mm (Helma) при 25 ° C със скорост 50 nm/min.CD спектрите бяха коригирани на базовата линия, осреднени за 10 придобивания и преобразувани в средна остатъчна елиптичност (θMRE) в градуси cm2/dmol:
където MW е молекулното тегло на всяка проба в Da;N е броят на аминокиселините;θ е елиптичността в милиградуси;d съответства на дължината на оптичния път в cm;концентрация на протеин в единици.