310 10*1 мм спираловидна тръба от неръждаема стомана химичен компонент, N-терминалните домени на спидроин образуват хидрогелове на базата на амилоидни фибрили и осигуряват платформа за имобилизиране на протеини.

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Плъзгачи, показващи три статии на слайд.Използвайте бутоните за връщане назад и напред, за да се движите през слайдовете, или бутоните за управление на плъзгачите в края, за да се движите през всеки слайд.

Спецификация

310 доставчици на спираловидни тръби от неръждаема стомана 10*1 mm

Химичен състав

Механични свойства

Рекомбинантните протеини от паяжинова коприна (протеини от паяжинова коприна) имат много потенциални приложения в разработването на нови биоматериали, но тяхната мултимодална и склонна към агрегация природа ги прави трудни за получаване и лесни за използване.Тук съобщаваме, че рекомбинантните миниатюрни спидроинови протеини и, което е важно, самият N-терминален домен (NT) бързо образуват самоподдържащи се и прозрачни хидрогелове при 37 ° C.слети протеини, състоящи се от NT и зелен флуоресцентен протеин или пурин нуклеозид фосфорилаза, образуват напълно функционални слети протеини.Хидрогелове.Нашите резултати показват, че рекомбинантните NT и слети протеини осигуряват високи добиви на експресия и придават на хидрогелове атрактивни свойства като прозрачност, желиране без омрежване и директно обездвижване на активни протеини при висока плътност.
Паяците имат до седем различни комплекта копринени жлези, всяка от които произвежда специфичен вид коприна.Всичките седем вида коприна са съставени от протеини на паяжина от коприна (спидроини) с дължина приблизително 6000 остатъка и съдържат голяма централна повтаряща се област, заобиколена от сферични N- и C-крайни домени (NT и CT) 1,2.Най-широко изучаваният тип коприна, първичната ампула, се произвежда от първичната ампулна жлеза.В тази жлеза монослой от епителни клетки синтезира спидроинови протеини и ги секретира в лумена на жлезата, където те присъстват в разтворима форма (допинг) при изключително високи концентрации (30–50% w/v)3,4.Организацията и конформацията на основните ампуларни спидроинови протеини в жлезата се обсъждат, но повечето експериментални доказателства показват наличието на обикновено спирална и/или произволна спирална конформация и мицеларни или ламеларни структури 5,6,7,8,9,10.Докато повтарящите се домейни регулират механичните свойства на копринените влакна, образувайки β-листови нанокристали и аморфни структури 11, 12, 13, 14, 15, крайните домейни регулират копринените влакна в отговор на променящите се условия по копринената жлеза 16, 17, 18.Чрез контролиране на образуването на коприна, 19. Терминалните домейни са еволюционно запазени и тяхната функция може да е обща за всички спидроинови протеини 2,20,21.По време на преминаването през жлезата рН на спидроина намалява от около 7,6 до < 5,716 и се повишава със срязване и разтягане, медиирано от движение през постепенно стесняващия се канал.В разтвор CT е α-спирален конститутивен паралелен димер17, но в отговор на ниско рН и сили на срязване, CT разгъва и превключва β-слоеве 16, 17, като вероятно задейства β-слоеве в повтарящите се области на Convert 16. NT са мономерни под условия, отразяващи условията в лумена на жлезата и медиират разтворимостта на спидроин, но при намалено рН, протонирането на редица странични вериги на карбоксилна киселина води до димеризация на NT с pKa от приблизително 6,5, като по този начин стабилизира NT и фиксира спидроин в големи количества.мрежи16,18.По този начин NT играе ключова роля в образуването на нишки, променяйки се от мономер в покритието до димер във влакното 23, 24, 25.NT остава силно разтворим и спираловиден при всички условия, проучени до момента 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, което вдъхнови неговото развитие като етикет за повишаване на разтворимостта за производството на хетероложни протеини.
Рекомбинантен мини копринен протеин от паяк, състоящ се от една NT, една къса повтаряща се област, един CT и His6 маркер (His-NT2RepCT) за пречистване, е толкова разтворим във воден буфер, колкото естествения протеин от копринена паяк и имитира естествените важни характеристики на копринения паяк .покривност 25.31.His-NT2RepCT може да се върти в непрекъснати влакна с помощта на биомиметична машина, в която разтворимо покритие с pH 8 се екструдира във водна баня с pH 525,32,33,34,35.Ферментация в биореактор на Е. coli, експресираща His-NT2RepCT, и последваща последваща обработка водят до >14 g/L добив след пречистване.Високият добив, високата разтворимост и адекватният отговор на His-NT2RepCT към киселинни условия се приписват на NT23, 25, 34.
Тук съобщаваме за бързото образуване на прозрачни хидрогелове от рекомбинантни спидроинови протеини, включително само NT, чрез инкубиране на протеинов разтвор при 37 ° C.Използвайки флуоресценция на тиофлавин Т (ThT), инфрачервена спектроскопия с трансформация на Фурие (FTIR), спектроскопия с ядрено-магнитен резонанс (NMR) и трансмисионна електронна микроскопия (TEM), ние открихме, че протеините NT и микропаяк претърпяват структурна трансформация в β-листове и амилоидоподобни фибрили когато се образуват гелове.В допълнение, слети протеини на NT и зелен флуоресцентен протеин (GFP) или пурин нуклеозид фосфорилаза (PNP) образуват хидрогелове с напълно функционални слети фрагменти.Експресията с висока производителност в хетероложни гостоприемници, съчетана с бързо образуване на хидрогелове при физиологични условия, отваря възможността за рентабилно производство на хидрогелове с инженерни функции.
За разлика от повечето докладвани рекомбинантни спидроинови протеини36, His-NT2RepCT е стабилен в Tris-HCl буфер при рН 8 и може да се концентрира до 500 mg/mL без утаяване25.Следователно, ние бяхме изненадани да открием, че този протеин бързо образува оптически чисти, самоподдържащи се хидрогелове, когато се инкубира при 37 ° C (фиг. 1b-d).Допълнителни проучвания показват, че желирането на His-NT2RepCT се извършва в широк диапазон от протеинови концентрации (10–300 mg/mL) и че тази концентрация е обратно пропорционална на времето на желиране (фиг. 1с и допълнителна фигура 1).За да разберем кои части от His-NT2RepCT медиират образуването на хидрогел, след това изследвахме всеки домейн поотделно и в различни комбинации, използвайки анализ на инверсия на колба (Фигура 1a, b).Всички тествани фракции на рекомбинантен спидроин образуват гелове (при концентрация на протеин от 300 mg/mL) за по-малко от 1 час, с изключение на утаения 2Rep (фиг. 1b).Това предполага, че NT и CT самостоятелно, в комбинация или свързани с повторения, могат да желират при 37°C и че маркерът His6 не влияе на този процес в значителна степен.Като се има предвид общото схващане, че NT е силно разтворим и стабилен протеин и че предишни доклади за рекомбинантни спидроинови хидрогелове приписват ефектите на желиране на конформационни промени в повтарящи се региони и/или CT, самият NT би могъл.Откриването на желирането беше неочаквано.Допълнителна таблица 1) 37, 38, 39. Забележително е, че NT вече се желира в рамките на 10 минути при концентрация ≥ 300 mg/mL (фиг. 1c).Експериментите с обръщане на флакона с различни концентрации на NT показват, че при >50 mg/mL разтворът на NT желира по-бързо от His-NT2RepCT при съответната концентрация (w/v, Фигура 1c).
Схематично представяне на различни конструкции на спидроин, изследвани в тази работа.b Време на желиране при 37 °C за различни рекомбинантни спидроинови протеини (300 mg/mL), потвърдено чрез обръщане на флакона.CT гел веднага без инкубация (<300 mg/mL), 2Rep преципитати (300 mg/mL, 5 mm мащаб).c Време на желиране на His-NT2RepCT и NT при посочените протеинови концентрации при 37°C.d Снимки на His-NT2RepCT и NT хидрогелове с паяка и буквата „NT“, отпечатани отдолу, съответно (и двете 200 mg/mL, скала 5 mm).
Хидрогеловете, образувани от различни рекомбинантни спидроинови протеини, имат леко различни цветове и наблюдението с невъоръжено око показва различни степени на прозрачност (фиг. 1b).NT геловете са изключително прозрачни, докато другите гелове стават непрозрачни.His-NT2RepCT и NT геловете, отлети в цилиндрични тръби, могат да бъдат отстранени от матрицата непокътнати (фиг. 1d).
За да се тества дали естествените покрития от паякообразна коприна се желират при условия, за които сега е установено, че причиняват желиране на рекомбинантните спидроинови протеини, бяха събрани покрития от голямата ампулна жлеза на шведския мостов паяк (Larinioides sclopetarius).Покритията се съхраняват в 20 mM Tris-HCl буфер при 50 mg/mL (на база измерено сухо тегло), но не се наблюдава желиране по време на 21-дневната инкубация при 37 °C (допълнителна фигура 2а).
За количествено определяне на тези гелове могат да се използват реологични измервания за изследване на процеса на желиране и определяне на цялостните механични свойства.По-специално, наблюдението на модула на съхранение (еластичност) при повишени температури може да предостави информация за температурата на желиране, както и за вискоеластични свойства на покритието.Експериментите за повишаване на температурата (използвайки 1°C/min при 25-45°C, въз основа на предишни проучвания, използващи изходни разтвори от естествена коприна)40,41 показват, че модулите за съхранение на His-NT2RepCT и NT разтворите се увеличават с повишаване на температурата.беше увеличен (фиг. 2 и допълнителна фигура 3).Трябва да се отбележи, че NT модулът започва да расте при по-ниска температура в сравнение с His-NT2RepCT, в съответствие с по-бързото време на гел, наблюдавано, когато NT се инкубира директно с His-NT2RepCT при 37 ° C (Фигура 1).След последващ спад на температурата, модулът за съхранение не се върна към по-ниски стойности и остана над модула на загуба (вижте допълнителна фигура 3), което показва термично необратимо стабилно желиране.След желиране крайният модул на еластичност варира от 15 до 330 kPa за His-NT2RepCT хидрогелове при концентрация от 100–500 mg/mL, а крайният модул на еластичност за NT хидрогелове (100–500 mg/mL) варира от 2 до 1400 kPa (фиг. , 2 и пълните данни за рампата) вижте допълнителна фигура 3).
a Промяна в температурата по време на измервания на His-NT2RepCT (300 mg/mL) и b NT (300 mg/mL) с разклащане.Стрелките показват температурната тенденция, а по-светлото оцветяване на данните от модула за съхранение изобразява тестване при по-ниски стойности на въртящия момент за инструмента от посочените от производителя, което е причината за повишения шум.c Натрупване в крайния модул на His-NT2RepCT и NT след повишена температура (100, 300 и 500 mg/mL).Всички показания на модула се вземат при честота от 0,1 Hz.
Като потенциален метод за изследване на конформационни промени, свързани с желирането, записахме FTIR спектри на His-NT2RepCT и NT преди и след желиране при 37 ° C (Фигура 3a, b).Както се очакваше, спектрите на разтворите His-NT2RepCT и NT съответстваха на протеини, показващи вторична структура на α-спирала/произволна намотка, с ясно изразена лента при 1645 cm-1.И за двата хидрогела, желирането доведе до образуването на две рамена в средната I лента при около 1617 cm-1 и 1695 cm-1 (фиг. 3a, b), което показва образуването на антипаралелни β-листови структури.Тези промени могат също така да се видят ясно в съответните втори производни и различни спектри на желиране (допълнителна фигура 4b).Двете ленти на NT β-слоя бяха по-изразени от тези на His-NT2RepCT, което показва, че общото съдържание на β-слойни ленти в NT хидрогела е по-високо от това на NT2RepCT хидрогела.
a FTIR абсорбционни спектри на His-NT2RepCT и b NT (и двата 500 mg/mL) преди (разтвор) и след (гел) инкубиране при 37°C.c TEM изображения на ресуспендирани 50 mg/ml NT2RepCT гелове и d NT.Мащабна лента 200 nm.д Диаметри на влакна на His-NT2RepCT и NT хидрогелове.n = 100 измерени фибрили, p < 0.0001.Лентите за грешки показват стандартното отклонение.Центърът на лентите за грешка е средната стойност.За статистически анализ беше използван несдвоен t-тест (двустранен).f ThT флуоресценция на различни рекомбинантни спидроинови протеини (100 mg/mL) при 37 °C без разклащане.g NT (100 mg/mL) експерименти с инокулация от 100 mg/mL NT гел с 0%, 5%, 10% и 20% семена.
Анализът на гела с помощта на трансмисионна електронна микроскопия (TEM) показа, че хидрогелът се състои от подобни на амилоид фибрили (фигури 3c, 3d).NT-образуваните фибрили са удължени (5–12 nm в диаметър) и неразклонени, докато His-NT2RepCT фибрилите са с по-къса дължина и значително по-широк в диаметър (7–16 nm) (фиг. 3e).Тези резултати ни позволиха да проследим кинетиката на фиброзата с помощта на теста за тиофлавин Т (ThT).За всички рекомбинантни спидроинови протеини, флуоресцентният сигнал се увеличава, когато пробите се инкубират при 37 ° C (фиг. 3f, допълнителна фигура 5а).В съответствие с това откритие, микроскопското изследване на NT и His-NT2RepCT при условия на желиране разкрива равномерно увеличение на ThT флуоресценцията без забележимо локално натрупване на ThT-позитивни агрегати (допълнителна фигура 5b, c).Образуването на ThT-позитивни фибрили не е придружено от увеличаване на мътността на NT и His-NTCT (допълнителна фигура 5d), което означава, че мрежа от фибрили в гела може да се образува, без да се компрометира яснотата на гела.Засяването чрез добавяне на малки количества предварително формирани фибрили може значително да ускори образуването на фибрили на някои амилоиди42, 43, 44, но добавянето на 5%, 10% или 20% (w/w) NT към разтвор на NT хидрокоагуланти.ефект на засяване (фиг. 3g).Може би това се дължи на факта, че фибрилите в хидрогела са относително фиксирани и не могат да се използват като семена.
Неочакваното поведение на рекомбинантните спидроинови протеини при високи температури предизвика по-нататъшни спектроскопски изследвания с ядрено-магнитен резонанс (NMR) за идентифициране на конформационни промени, свързани с образуването на гел.ЯМР спектрите на His-NT2RepCT разтвори, записани с течение на времето при 37°C, показват, че CT все още е частично сгънат, докато NT и 2Rep сигналите са изчезнали (фиг. 4а), което предполага, че основно NT и 2Rep частично контролират образуването на His- NT2RepCT хидрогел.CT сигналът също беше отслабен до 20% от първоначалния си интензитет, което предполага, че CT също е предимно фиксиран и включен в структурата на хидрогела.За по-малка част от CT, която е толкова подвижна, колкото в предварително инкубираната проба и по този начин наблюдавана чрез ЯМР на разтвора, в спектрите липсват сигнали за първите 10 структурирани остатъка, вероятно поради трудното обездвижване на прикрепената част от His-NT2Rep.NMR спектрите на -състоянието на хидрогеловете -NT2RepCT разкриват преобладаващото присъствие на α-спирали и β-слоеве и, в по-малка степен, произволната конформация на намотка (фиг. 4b).Анализът на химическото изместване на метиониновите остатъци, присъстващи само в NT, показва, че този домейн е превърнат в структура на β-лист.Зависимите от времето спектри на NT в разтвора показват равномерно намаляване на интензитета на сигнала (фиг. 4с), а NMR в твърдо състояние на NT хидрогелове показва, че повечето от NT остатъците са превърнати в β-листови структури (фиг. 4d).Конформацията на 2Rep не може да бъде определена отделно поради склонността му към агрегиране.Въпреки това, NMR спектрите на твърдо състояние на хидрогеловете NTCT и His-NT2RepCT изглеждаха много сходни (фиг. 4b; допълнителна фигура 6b), което предполага, че 2Rep е допринесъл малко за структурната част на хидрогела His-NT2RepCT.За CT хидрогелове е установено, че съществуват α-спирали, β-листове и произволни спирални вторични структури (допълнителна фигура 6d).Това предполага, че някои части от CT остават α-спирали, докато други стават β-листове.По този начин резултатите от NMR спектроскопията предполагат, че NT е важен за образуването на хидрогел и също така се трансформира в конформация на β-лист при сливане с 2Rep и CT.В съответствие с това, наскоро открихме, че амилоидните пространствени ципове вероятно се образуват във всичките пет спирали на NT домейна и алгоритъмът на Waltz прогнозира амилоидогенна област в спирала 1 (фиг. 4е).
2D спектри на 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT разтвор преди (синьо) и 19 часа след инкубиране (червено) при 37°C.Индивидуалните кръстосани пикове в червения спектър и F24, G136, polyA в синия спектър са обозначени с еднобуквени символи на аминокиселини и номера на остатъци.Вмъкванията показват зависимостта на интензитета на сигнала от времето за избрани остатъци от NT, 2Rep и CT домейни.b Радиочестотни спектри в твърдо състояние (RFDR) на His-NT2RepCT хидрогелове.Корелациите на Cα/Cβ остатъци, наблюдавани в спектрите на RFDR, бяха определени чрез сравнение с моделни пептидни химически отмествания и стойности, получени от статистиката82,83 и техните вторични структури.SSB – въртяща се странична лента.c Едномерни спектри на 15N-HSQC 10 mg/mL NT разтвор по време на инкубиране при 37 °C за 36 часа.Вмъкването показва обемен интензитет спрямо времето.d RFDR спектри в твърдо състояние на NT хидрогелове.Посочени са корелациите на Cα/Cβ остатъци и техните вторични структури, наблюдавани в RFDR спектрите.д Въз основа на профила на склонност към фибрилация NT45.79 от базата данни Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Енергията Rosetta на прозореца за пространствено изместване на светкавицата на хексапептида е показана в kcal/mol.Червените ленти означават хексапептиди с висока склонност към фиброза (енергия на Розета под -23 kcal/mol; под пунктираната линия).Зелените ленти показват фрагменти с енергии на Rosetta над прага и следователно е по-малко вероятно да образуват пространствени ципове.Фрагменти, съдържащи пролин, бяха изключени от анализа (без колони).Квадратите показват области на амилоидоза, предсказани от алгоритъма Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Последователността на аминокиселинните остатъци на NT е в горната част, а видовете остатъци, открити в β вторичната структура (определена чрез NMR спектроскопия в твърдо състояние) са показани в червено.Позициите на петте NT α-спирали са обозначени като (H1-H5)28.
При pH <6,5, HT димеризира, като е устойчив на денатурация, предизвикана от топлина или урея18.За да се изясни как димеризацията и стабилността на NT влияят върху желирането, разтвори, съдържащи 100 mg/ml NT, се контролират при рН 8, 7 и 6, като се използва тестът за обръщане на флакона.NT проби, инкубирани при рН 8 и 7, се желират след 30 минути при 37 ° С, но гелът с рН 8 остава бистър, докато гелът с рН 7 показва видима утайка (фиг. 5а).За разлика от това, разтвор, съдържащ НТ при рН 6, не образува гел и може да се види голяма утайка след 20 минути при 37 ° С.Това предполага, че самите димери и/или тяхната по-висока стабилност в сравнение с мономерите предотвратяват желирането.Образуването на утайка за NT при рН 7 и 6 не се очаква, тъй като е съобщено, че NT е разтворим при 200 mg/ml27, лесно се пренагъва след топлинна денатурация и също така запазва α-спирала при по-ниски стойности на pH 18. Вероятно обяснение за тези несъответствия е, че докладваните по-рано експерименти са проведени при стайна температура или по-ниска, или при относително ниски концентрации на протеин 16,18,19.
Тест за обръщане на NT флакон (100 mg/mL) при рН 8, 7, 6 и 154 mM NaCl (рН 8) след инкубиране при 37°C.b NT CD спектри със и без 154 mM NaF и 154 mM NaCl, съответно.Моларната елиптичност при 222 nm се преобразува в част от естествените гънки.c NT инверсионен анализ (100 mg/mL) NT* (37 °C и 60 °C), NTA72R (37 °C) и His-NT-L6 (37 °C и 60 °C).d CD спектри на NT мутанти NT*, NTA72R и His-NT-L6.Моларната елиптичност при 222 nm се преобразува в част от естествените гънки.e Тест за инверсия на NTFlSp, NTMiSp и намален NTMiSp (100 mg/mL).Скала 5 мм.f CD спектри на NT, NTFlSp, NTMiSp и намален NTMiSp.Моларната елиптичност при 222 nm се преобразува в част от естествените гънки.Пълните NT спектри при 25 °C и 95 °C са показани на допълнителна фигура 8.
Физиологичната концентрация на сол определя електростатичните взаимодействия между NT субединиците и димеризацията на NT трансфера до по-ниско pH18.Ние открихме, че присъствието на 154 mM NaCl и NaF наистина инхибира съответно желирането (Фиг. 5a, b; Допълнителна Фигура 2b) и че тези соли повишават термичната стабилност на NT мономерите (Фиг. 5b, Допълнителна Фигура 8) .Това също предполага, че повишаването на стабилността, а не димеризацията, предотвратява образуването на гел.
За по-нататъшно изследване на ролята на димеризацията и стабилността на протеина в желирането, ние използвахме два мутанта, NT* и NTA72R, които също остават мономерни при ниско pH28.30.NT* е мутант с двойно обръщане на заряда, при който очевидното диполярно разпределение на заряда на мономера е изравнено, което предотвратява димеризацията и драстично повишава стабилността на мономера.NTA72R е зареден дипол, но Arg-заместен Ala е разположен на границата на димера, така че мутациите пречат на взаимодействията на субединиците, необходими за димеризация.При инкубиране при 37 ° С, NT * не образува хидрогел, докато NTA72R образува непрозрачен гел за 15 минути (фиг. 5с).Тъй като както NT*, така и NTA72R не могат да димеризират, но се различават по стабилност на мономера (фиг. 5d), тези резултати силно предполагат, че високата термодинамична стабилност предотвратява желирането на NT.Това се подкрепя и от факта, че HT* образува гел, когато е нестабилен при висока температура (след 8 минути при 60°C; фиг. 5c).По-рано беше показано, че високото съдържание на метионин в NT втечнява естественото му сгъване и че шест заместителя Met до Leu (наричани тук His-NT-L6) силно стабилизират мономера NT46.Въз основа на предположението, че е необходима структурна гъвкавост за образуването на NT гел, ние открихме, че стабилният His-NT-L6 мутант не желира при 37 ° C (Фигура 5c, d).His-NT-L6 обаче също образува гел при инкубиране при 60°С за 60 min (фиг. 5в).
Способността на NT да се трансформира в β-листови структури и да образува хидрогелове изглежда се прилага за някои, но не всички NT домейни на спидроин.NT от различни типове коприна и видове паяци, Trichonephila clavipes (NTFlSp), образуват гелове въпреки относително ниското им съдържание на метионин и висока термична стабилност (фиг. 5e, f и допълнителна таблица 2).За разлика от това, NT от малкия ампуларен протеин спидроин от Araneus ventricosus (NTMiSp) с ниска термична стабилност и високо съдържание на метионин не образува хидрогелове (допълнителна таблица 2 и фиг. 5e, f).Последното може да бъде свързано с наличието на вътрешномолекулни дисулфидни връзки 29, 47.Последователно, когато дисулфидните връзки на NTMiSp бяха редуцирани, той образува хидрогел след инкубиране при 37 ° С за 10 минути (фиг. 5е).В заключение трябва да се отбележи, че структурната гъвкавост е важен, но не единственият критерий за образуването на гел от NT.Друг фактор, който може да бъде от значение, е склонността към образуване на амилоидни фибрили, а анализът с базата данни с цип и алгоритъмът Waltz показа корелация между способността за образуване на гелове и наличието на амилоидогенни региони, както и степента на предвидените региони за образуване на пространствени ципове.Имаше корелация (допълнителна таблица 2 и допълнителна фигура 9).
Способността на NT да образува фибрили и да образува гелове при благоприятни условия ни накара да предположим, че сливания на NT с други протеинови фрагменти все още могат да образуват гелове с пълна функция на партньори за сливане.За да тестваме това, въведохме зелен флуоресцентен протеин (GFP) и пурин нуклеозид фосфорилаза (PNP) съответно в С-края на NT.Получените слети протеини се експресират в E. coli с много високи крайни добиви (150 mg/L и 256 mg/L култури в разклащаща се колба съответно за His-NT-GFP и His-NT-PNP), в съответствие с показаното за други протеини, слети с NT Ref.30. Слетите протеини His-NT-GFP (300 mg/mL) и His-NT-PNP (100 mg/mL) образуват гелове след 2 часа и 6,5 часа при 37°C и, което е важно, GFP фракцията остава непроменена.наблюдавани след желиране, с >70% от първоначалния интензитет на флуоресценция, оставащ след желиране (фиг. 6а).За да измерим активността на PNP в his-NT-PNP разтвори и гелове, трябваше да разредим слетия протеин с NT, тъй като ензимната активност на чистия препарат беше извън обхвата на откриване на анализа при концентрации на желиране.Гелът, образуван със смес, съдържаща 0.01 mg/mL His-NT-PNP и 100 mg/mL NT, запазва 65% от първоначалната ензимна активност на предварително инкубираните проби (фиг. 6b).Гелът остава непокътнат по време на измерването (допълнителна фигура 10).
a Относителен интензитет на флуоресценция преди и след желиране на His-NT-GFP (300 mg/mL) и обърнат флакон, съдържащ His-NT-GFP хидрогел (300 mg/mL) под видима и UV светлина.Точките показват индивидуални измервания (n = 3), лентите за грешки показват стандартно отклонение.Средната стойност е показана в центъра на лентите за грешки.b PNP активността е получена чрез флуорометричен анализ с помощта на разтвори и гелове, състоящи се от NT (100 mg/ml) и смес, съдържаща 0,01 mg/ml his-NT-PNP и 100 mg/ml нови тайвански долари.Вложката показва обърнат флакон, съдържащ хидрогел, съдържащ His-NT-PNP (5 mm скала).
Тук съобщаваме за образуването на хидрогелове от NT и други рекомбинантни спидроинови протеини чрез инкубиране на протеинов разтвор при 37 ° C (Фигура 1).Ние показваме, че желирането е свързано с трансформацията на α-спиралите в β-слоеве и образуването на подобни на амилоид фибрили (Фигури 3 и 4).Това откритие е изненадващо, тъй като NTs са навити кълбовидни снопове с пет спирали, известни със своята изключително висока разтворимост и висока стабилност при концентрации >200 mg/mL при 4°C за няколко дни27.В допълнение, NTs лесно се пренагъват след топлинна денатурация при ниски протеинови концентрации в µM.Според нашите резултати, образуването на фибрили изисква комбинация от концентрация на протеин >10 mg/mL и леко повишена температура (фиг. 1).Това е в съответствие с идеята, че амилоидните фибрили могат да се образуват от глобуларно нагънати протеини, които са в частично разгънато състояние поради термични флуктуации при физиологични условия 48 .Примери за протеини, които претърпяват това превръщане, включват инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин и лизозим51,52,53.Въпреки че NT е α-спирала в естественото си състояние, приблизително 65% от полипептидната верига е съвместима с образуването на пространствена ципа (фиг. 4e) 45 .Тъй като мономерът е динамично подвижен46, той може да изложи тези потенциални амилоидогенни области при умерено повишени температури и при високи концентрации на общ протеин може да достигне критична концентрация за образуване на амилоидни фибрили54.Следвайки това разсъждение, ние открихме отрицателна корелация между концентрацията на спидроин и времето на желиране (фиг. 1в) и ако мономерната NT конформация е стабилизирана или чрез мутации (NT*, His-NT-L6) или чрез добавяне на сол, може да предотврати образуване на хидрогелове (фиг. 5).
В повечето случаи амилоидните фибрили изчезват от разтвора като утайка, но при определени условия те могат да образуват хидрогелове55,56,57.Фибрилите, образуващи хидрогел, обикновено имат високо аспектно съотношение и образуват стабилни триизмерни мрежи чрез молекулярно заплитане, 55, 58 в съответствие с нашите резултати.За образуването на хидрогел in vitro, протеините често се разгъват напълно или частично, например чрез излагане на органични разтворители, висока температура (70–90°C) и/или ниско pH (1,5–3,0) 59,60,61,62.Описаните тук спидроинови хидрогелове не изискват тежка обработка, нито пък омрежващи агенти за стабилизиране на хидрогеловете.
По-рано беше съобщено, че повторенията на спидроин и КТ, които изглежда претърпяват превключване на β-листа по време на предене на коприна, образуват хидрогелове.В сравнение с нашите открития, инкубационните времена и/или инкубационните температури бяха съответно значително по-дълги или по-високи и получените хидрогелове често бяха непрозрачни (Фигура 7 и Допълнителна таблица 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. В допълнение към бързите времена на желиране, NT хидрогеловете >300 mg/mL (30%) превъзхождат всички други описани рекомбинантни хидрогелове на протеин от паяжина коприна, както и естествени хидрогелове като желатин, алгинат (2%), агар (0,5% ) и колаген.(0,6%) (Фигура 7 и допълнителни таблици 1 и 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Времето на желиране и модулът на еластичност на хидрогеловете в това изследване бяха сравнени с други хидрогелове на базата на спидроин и избрани естествени хидрогелове.Препратките са дадени заедно с описание на условията на желиране.APS Амониев персулфат, стайна температура.Данни 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Изглежда, че паяците са разработили начини да предотвратят желирането на спидроина по време на съхранение.Въпреки високата концентрация на протеин в копринената жлеза, голямата повтаряща се област, свързана с крайния домен, означава, че видимата концентрация на NT и CT в жлезата съответства на приблизително 10-20 mg/ml на границата на това изследване.необходими за in vitro наблюдавано образуване на хидрогел.В допълнение, подобни концентрации на соли 16 стабилизират NT, както в копринените жлези (фиг. 5b).Конформацията на NT е изследвана в цитозола на E. coli и е установено, че е по-плътно нагъната, отколкото при изследване in vitro, което допълнително показва, че солта или други фактори предотвратяват нейната агрегация in vivo.Въпреки това, способността на NTs да се трансформират в β-листови фибрили може да бъде важна за образуването на нишки и трябва да бъде изследвана в бъдещи проучвания.
В допълнение към новите аспекти на образуването на NT-амилоид-подобен фибрил и хидрогел, наблюдавани в това изследване, ние също така показваме, че това явление може да има биотехнологични и биомедицински приложения (фиг. 8).Като доказателство за концепцията, ние комбинирахме NT с GFP или PNP и показахме, че слетият протеин също образува хидрогелове, когато се инкубира при 37 ° C и че GFP и PNP фракциите до голяма степен запазват своята активност след желиране (Фигура 6).Нуклеозидните фосфорилази са важни катализатори за синтеза на нуклеозидни аналози75, което прави нашето откритие уместно за биофармацевтичната индустрия.Концепцията за експресиране на слети протеини, които образуват прозрачни хидрогелове при благоприятни условия, позволява създаването на функционализирани хидрогелове с благоприятни свойства за широк спектър от приложения като имобилизиране на ензими, контролирано освобождаване на лекарства и тъканно инженерство.В допълнение, NT и NT * са ефективни експресионни маркери30, което означава, че NT и неговите варианти могат да се използват за високопроизводително производство на разтворими слети протеини и последващо създаване на имобилизирани целеви протеини в 3D хидрогелове.
NT е разтворим, α-спирален и стабилен при ниски концентрации (µM) и 37°C.При същата температура, но при нарастващи концентрации (>10 mg/ml), NT образува гелове, състоящи се от подобни на амилоид фибрили.NT слетите протеини също образуват фибриларни гелове с напълно функционални слети фрагменти, което позволява различни протеини да бъдат имобилизирани в 3D хидрогелове с помощта на NT.Долу: NT (PDB: 4FBS) и илюстрации на влакнести мрежи и свързани протеинови структури (приети и неначертани в мащаб, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Конструкциите (вижте допълнителна таблица 4 за пълен списък, включващ аминокиселинни последователности) бяха клонирани в плазмид pT7 и трансформирани в E. coli BL21 (DE3).Е. coli, съдържащи конструирани плазмиди, се инокулират в бульон Luria, допълнен с канамицин (70 mg/l) и се отглеждат една нощ при 30°C и 250 rpm.След това културата се инокулира 1/100 в LB среда, съдържаща канамицин и се култивира при 30°С и 110 rpm, докато OD600 достигне 0,8.За NMR изследвания, бактериите се отглеждат в минимална среда M9, съдържаща 2 g D-глюкоза 13C (Aldrich) и 1 g амониев хлорид 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) за протеиново маркиране с изотопи.Намалете температурата до 20 градуса по Целзий и индуцирайте протеинова експресия с 0,15 mM изопропилтиогалактопиранозид (крайна концентрация).След експресия на протеин за една нощ, клетките бяха събрани при 7278 × g, 4 ° С за 20 минути.Клетъчните пелети се ресуспендират в 20 mM Tris-HCl, рН 8, и се замразяват до следваща употреба.Размразените клетки се лизират с помощта на клетъчен разрушител (машини от серия TS, Constant Systems Limited, Англия) при 30 kPa.След това лизатите се центрофугират при 25 000 g за 30 минути при 4°C.За NTMiSp пелетата след това се ресуспендира в 2 М урея, 20 mM Tris-HCl, pH 8 и се обработва с ултразвук в продължение на 2 минути (2 s вкл./изкл., 65%), след което се центрофугира отново при 25 000 xg, 4°C в рамките на 30 мин.Супернатантата се зарежда в Ni-NTA колона, промива се с 20 mM Tris-HCl, 2 mM имидазол, рН 8 и накрая протеинът се елуира с 20 mM Tris-HC1, 200 mM имидазол, рН 8. За генериране на NT2RepCT и NTCT, смилането на тромбина въвежда мястото (ThrCleav) между His и NT.Места на разцепване на тромбин също присъстват в His-NT-ThrCleav-2Rep (произвежда 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (произвежда NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (произвежда CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (произвежда NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (произвежда NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (произвежда NTF1Sp) и His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (произвежда NTMiSp).Конструктите се усвояват с тромбин (1:1000) и се диализират една нощ при 4°С с 20 mM Tris-HCl, рН 8, като се използва Spectra/Por диализна мембрана с праг на молекулно тегло от 6-8 kDa.След диализа разтворът се зарежда в Ni-NTA колона и изтичащата вода, съдържаща интересуващия ни протеин, се събира.Концентрациите на протеин се определят чрез измерване на UV абсорбцията при 280 nm, като се използва коефициентът на екстинкция на всеки протеин, с изключение на NTF1Sp, който използва анализа на Bradford съгласно протокола на производителя.Чистотата се определя чрез SDS полиакриламидна (4–20%) гел електрофореза и оцветяване с брилянтно синьо Coomassie.Протеините се концентрират с помощта на центрофужни филтри (VivaSpin 20, GE Healthcare) при 4000 xg с прекъсване на молекулното тегло 10 kDa в 20-минутни цикли.
Размразете протеиновия разтвор и внимателно пипетирайте 150 µl във флакон с прозрачна преграда от 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Епруветките се затварят и запечатват с парафилм, за да се предотврати изпарението.Пробите (n = 3) се инкубират при 37°C или 60°C и периодично се обръщат, за да се наблюдава желирането.Проби, които не желираха, бяха инкубирани поне една седмица.Намалете NTMiSp дисулфидните връзки с 10 mM DTT на 10 µM протеин.За да се анализира желирането на естествени копринени покрития от паяк, паякът от шведския мост беше отрязан, двете главни ампулирани жлези бяха поставени в 200 μl от 20 mM Tris-HCl буфер pH 8 и отрязани, за да се позволи на покритието да се отдели от жлезите..Съдържанието на жлезите се разтваря в буфер, 50 µl за определяне на сухо тегло (чрез инкубиране на отворени флакони при 60 °C до постоянно тегло) и 150 µl за желиране при 37 °C.
Измервателната геометрия/инструментът е направен от неръждаема стомана с помощта на успоредна плоча с горен диаметър 20 mm и междина 0,5 mm.Загрейте пробата от 25 °C до 45 °C и обратно до 25 °C със скорост 1 °C на минута, като използвате плоча на Пелтие от неръждаема стомана.Вибрационните измервания се извършват при честота от 0,1 Hz и в линейната вискоеластична област на материала при деформация от 5% и 0,5% за проби съответно от 100 mg/mL и 300–500 mg/mL.Използвайте персонализирана камера за влажност, за да предотвратите изпарението.Данните бяха анализирани с помощта на Prism 9.
За събиране на инфрачервени (IR) спектри при стайна температура от 800 до 3900 cm–1.ATR устройството, както и светлинният път през спектрометъра, се продухват със сух филтриран въздух преди и по време на експеримента.Разтвори (500 mg/mL за минимизиране на пиковете на абсорбция на вода в спектрите) се пипетират върху кристалите и се образуват гелове (500 mg/mL) преди измерването и след това се прехвърлят към кристалите (n = 3).Бяха записани 1000 сканирания с разделителна способност от 2 cm-1 и нулев работен цикъл от 2. Втората производна беше изчислена с помощта на OPUS (Bruker), използвайки диапазон на изглаждане от девет точки.Спектрите бяха нормализирани към същата област на интегриране между 1720 и 1580 cm-1 с помощта на F. Menges “Spectragryph – софтуер за оптична спектроскопия”.При ATR-IR спектроскопията дълбочината на проникване на инфрачервения лъч в проба зависи от вълновото число, което води до по-силно поглъщане при по-ниски вълнови числа, отколкото при по-високи вълнови числа.Тези ефекти не са коригирани за спектрите, показани на фиг.3, тъй като те са много малки (допълнителна фигура 4).Коригираните спектри за тази фигура бяха изчислени с помощта на софтуера Bruker OPUS.
По принцип е възможно цялостно количествено определяне на протеиновите конформации след надеждна деконволюция на компонентите в пика на амид I.На практика обаче възникват някои пречки.Шумът в спектъра може да се появи като (фалшиви) пикове по време на деконволюция.В допълнение, пикът, дължащ се на огъване на водата, съвпада с позицията на пика на амид I и може да има подобна величина за проби, съдържащи голямо количество вода, като водния гел, изследван тук.Следователно, ние не се опитахме да разложим напълно пика на амид I и нашите наблюдения трябва да се разглеждат само в подкрепа на други методи като NMR спектроскопия.
Разтвори от 50 mg/ml NT и His-NT2RepCT се желират за една нощ при 37°С.След това хидрогелът се разрежда с 20 mM Tris-HCl (рН 8) до концентрация от 12,5 mg/ml, разклаща се добре и се пипетира, за да се разчупи гела.След това хидрогелът се разрежда 10 пъти с 20 mM Tris-HCl (рН 8), 5 μl от пробата се нанасят върху медна решетка, покрита с формавар, и излишната проба се отстранява с попивателна хартия.Пробите се промиват два пъти с 5 µl MilliQ вода и се оцветяват с 1% уранил формиат за 5 минути.Отстранете излишното петно ​​с абсорбираща хартия, след което изсушете мрежата на въздух.Изобразяването беше извършено върху тези решетки с помощта на FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, работещ при 100 kV.Изображенията бяха записани при x 26 500 и x 43 000 увеличения с помощта на Veleta 2k × 2k CCD камера (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Германия).За всяка проба (n = 1) бяха записани 10–15 изображения.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) беше използван за анализ на изображения и измерване на диаметри на влакна (n = 100, различни влакна).Призма 9 беше използвана за извършване на несдвоени t-тестове (двустранни).Средните His-NT2RepCT и NT фибрили бяха съответно 11,43 (SD 2,035) и 7,67 (SD 1,389) nm.Доверителният интервал (95%) е от -4,246 до -3,275.степени на свобода = 198, p < 0.0001.
80 µl течни проби, съдържащи 10 µM тиофлавин Т (ThT), бяха измерени трикратно (n = 3) при статични условия, като се използваха Corning 96-ямкови плаки с черно дъно и прозрачно дъно (Corning Glass 3881, САЩ).Флуоресцентните разлики бяха записани с помощта на 440 nm възбуждащ филтър и 480 nm емисионен филтър (FLUOStar Galaxy от BMG Labtech, Offenburg, Германия).Сигналът ThT не беше нито наситен, нито угасен, тъй като бяха проведени експерименти с различни концентрации на ThT без промяна на интензитета на сигнала.Запишете абсорбцията при 360 nm за измерване на мъглата.За експерименти със засаждане, 100 mg/mL гелове се образуват при 37°С, ресуспендират се и се използват за засаждане при моларни съотношения от 5%, 10% и 20%.Данните бяха анализирани с помощта на Prism 9.
Размразете запасите от His-NT2RepCT и NT >100 mg/mL върху лед и филтрирайте през 0,22 µm филтър.Концентрациите се изчисляват чрез измерване на абсорбцията при 280 nm с помощта на Nanodrop.В ямки на 96-ямкова черна несвързваща плака (Corning) с чисто дъно, пробите се разреждат до 20 mg/ml в 20 mM Tris-HCl pH 8 и се смесват с 5 μM ThT (крайна концентрация), обща концентрация на пробата 50 μl обем.Пробите се изобразяват на всеки 10 минути при 37 °C на микроскоп CellObserver (Zeiss) с канал за предавана светлина и комплекти филтри за възбуждане и излъчване на FITC за ThT изображения.За изображения се използва обектив 20x/0.4.Zen Blue (Zeiss) и ImageJ (https://imagej.nih.gov/) бяха използвани за анализ на изображения.Геловете също се приготвят от NT и His-NT2RepCT разтвори в концентрация от 50 mg/mL, съдържащи 20 mM Tris pH 8 и 5 µM ThT и се инкубират при 37°C за 90 минути.Парчетата гел се прехвърлят в нова ямка, съдържаща 20 mM Tris, pH 8 и 5 μM ThT в необвързваща черна 96-ямкова плака с прозрачно дъно.Получете зелена флуоресценция и изображения в ярко поле при увеличение 20x/0,4.ImageJ беше използван за анализ на изображения.
ЯМР спектрите на разтвора са получени при 310 К на 600 MHz Bruker Avance Neo спектрометър, оборудван с QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).ЯМР проби, съдържащи 10 mg/mL хомогенен протеин, белязан с 13C, 15N, разтворен в 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Химичните отмествания на NT2RepCT при рН 6.7 бяха използвани за определяне на пик 23 в 2D спектъра на 15N-HSQC.
Въртящият се под магически ъгъл NMR (MAS) спектри на 13C, 15N-белязани хидрогелове бяха записани на Bruker Avance III HD спектрометър при 800 MHz, оборудван с 3.2 mm 13C/15N{1H} безелектронна сонда.Температурата на пробата се контролира с помощта на газов поток с променлива температура при 277 К. Спектрите на двумерен диполен ротационен резонанс (DARR)76 и радиочестотно повторно свързване (RFDR)77 се получават при MAS честоти от 12,5 kHz и 20 kHz, съответно.Кръстосаната поляризация (CP) от 1H до 13C се извършва с помощта на линейна промяна от 60.0 до 48.0 kHz при 1H, 61.3/71.6 kHz при 13C (при 12.5/20 kHz MAS) и време за контакт 0.5–1 ms.По време на събирането на данни беше използвано отделяне на Spinal6478 при 73, 5 kHz.Времето за придобиване беше 10 милисекунди, а забавянето на цикъла беше 2,5 секунди.Едносвързаните Cα/Cβ корелации, наблюдавани в спектрите на RFDR, бяха присвоени на базата на характерните химически отмествания от тип остатък и многосвързаните корелации в спектрите на DARR.
Базата данни Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) беше използвана за оценка на тенденциите на трептене и енергията на Rosetta за NT, NTFlSp и NTMiSp.Базата данни Zipper изчислява Rosetta Energy80, която съчетава няколко функции за свободна енергия за моделиране и анализиране на протеинова структура.Енергийно ниво от -23 kcal/mol или по-ниско показва висока склонност към фибрилация.По-ниската енергия означава повече стабилност на двете β-вериги в конформацията на ципа.В допълнение, алгоритъмът на Waltz беше използван за прогнозиране на амилоидогенни региони в NT, NTFlSp и NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Разтворът на NT протеин се смесва с буфер от 2-(N-морфолино)етансулфонова киселина (MES) при рН 5.5 и 6.0, за да се понижи рН съответно до рН 6 и 7.Крайната протеинова концентрация беше 100 mg/ml.
Измерванията бяха извършени на спектрометър J-1500 CD (JASCO, САЩ), като се използва кювета от 300 μL с оптичен път от 0, 1 cm.Протеините се разреждат до 10 μM (n = 1) в 20 mM фосфатен буфер (рН 8).За да се анализира стабилността на протеина в присъствието на сол, протеините се анализират при същата концентрация (n = 1) в 20 mM фосфатен буфер (рН 8), съдържащ съответно 154 mM NaF или NaCl.Температурните сканирания бяха записани при 222 nm от 25°C до 95°C със скорост на нагряване от 1°C/min.Делът на естествено нагънатите протеини се изчислява с помощта на формулата (KD measure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Освен това бяха записани пет спектъра за всяка проба от 260 nm до 190 nm при 25°C и след нагряване до 95°C.Пет спектъра бяха осреднени, изгладени и превърнати в моларна елиптичност.Данните бяха анализирани с помощта на Prism 9.
Интензитетът на флуоресценция на His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) се измерва трикратно (n = 3) в 96-ямкови Corning плаки с черно прозрачно дъно (Corning Glass 3881, САЩ) при статични условия.Измерете пробите с флуоресцентен четец на плаки с дължина на вълната на възбуждане 395 nm и запишете емисиите при 509 nm преди желиране и 2 часа по-късно при 37°C.Данните бяха анализирани с Prism 9.
Използва се комплект за анализ на активността на пурин нуклеозид фосфорилаза (флуорометричен метод, Sigma Aldrich) съгласно инструкциите на производителя.За измерване на активността в гелове и разтвори, съдържащи His-NT-PNP, смесете 10 ng His-NT-PNP със 100 mg/mL NT до общ обем от 2 µL, тъй като гелът даде сигнал над интервала на откриване на комплекта.Бяха включени контроли за гелове и разтвори без His-NT-PNP.Измерванията бяха проведени два пъти (n = 2).След измерване на активността реакционната смес се отстранява и гелът се снима, за да се гарантира, че гелът остава непокътнат по време на измерването.Данните бяха анализирани с помощта на Prism 9.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на проучването Nature, свързано с тази статия.
Фигури 1 и 2 представят изходните данни.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f и 6, допълнителни фигури.3, допълнителна фиг.5a, d, допълнителна фиг.6 и допълнителна фиг.8. Данни Данните от това проучване се хостват в базата данни Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Данните за ЯМР, получени в това проучване, бяха публикувани в хранилището на BMRBig под ID на запис bmrbig36.Структурите на GFP и PNP са взети от PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. и Johansson, J. Предене на изкуствена паякова коприна.National Chemical.биология.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Геномът на Nephila clavipes подчертава разнообразието от гени на паяковата коприна и тяхната сложна експресия.Национален Женет.49, 895–903 (2017).