347 12,7*1,24 mm спираловидна тръба от неръждаема стомана, молекулярен механизъм на синхронна електростатична кондензация и коагрегация на α-синуклеин и тау

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Плъзгачи, показващи три статии на слайд.Използвайте бутоните за връщане назад и напред, за да се движите през слайдовете, или бутоните за управление на плъзгачите в края, за да се движите през всеки слайд.

Спецификация на тръбата от неръждаема стомана 347

347 12,7*1,24 mm спираловидна тръба от неръждаема стомана

Външен диаметър: 6,00 mm OD до 914,4 mm OD, размери до 24” NB налични на склад, стоманени тръби с външен размер налични на склад

SS 347 Дебелина на тръбата: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S и т.н. (0,5-12 mm) Или нестандартен размер, който да бъде съобразен според изискванията

Тип: SS 347 Безшевни тръби |SS 347 ERW тръби |SS 347 Заварени тръби |SS 347 Произведени тръби |SS 347 CDW тръби, LSAW тръби / шевно заварени / преначертани

Форма: SS 347 Кръгли тръби/тръби, SS 347 Квадратни тръби/тръби, SS 347 Правоъгълни тръби/тръби, SS 347 навити тръби, SS 347 „U” форма, SS 347 Pan Cake рулони, SS 347 Хидравлични тръби

Дължина: единична произволна, двойна произволна и необходима дължина Край: обикновен край, скосен край, стъпало

Крайна защита: Пластмасови капачки |Външно покритие: 2B, No.4, No.1, No.8 огледално покритие за тръби от неръждаема стомана, покритие според изискванията на клиента

Състояние на доставка: отгрято и мариновано, полирано, ярко отгрято, студено изтеглено

Инспекция, протоколи от тестове: Сертификати за изпитване на мелница, EN 10204 3.1, химически доклади, механични доклади, PMI тестови доклади, визуални инспекционни доклади, инспекционни доклади на трети страни, одобрени от NABL лабораторни доклади, доклади за разрушителни тестове, доклади за неразрушителни тестове

Опаковка: Опаковани в дървени кутии, найлонови торбички, пакетирани стоманени ленти или според заявките на клиентите

Специални предложения: Размери и спецификации, различни от горните, могат да бъдат произведени при поискване

SS 347 Диапазон на размера на тръбата: 1/2 инча NB, OD до 24 инча

ASTM A312 347: Безшевни и заварени с прав шев аустенитни тръби, предназначени за работа при висока температура и обща корозия.По време на заваряване не се допуска добавъчен метал.

ASTM A358 347: Електрически заварени аустенитни тръби за корозивни и/или високи температури.Обикновено по тази спецификация се произвежда само тръба до 8 инча.По време на заваряването е разрешено добавянето на присаден метал.

ASTM A790 347: Безшевни и заварени с прав шев феритни/аустенитни (дуплексни) тръби, предназначени за общо корозионно обслужване, със специален акцент върху устойчивостта на корозионно напукване под напрежение.

ASTM A409 347: Аустенитна тръба с леки стени с прав шев или спираловиден шев, електрически заварена с голям диаметър, с размери от 14” до 30” със стени Sch5S и Sch 10S за корозионни и/или високи

ASTM A376 347: Безшевна аустенитна тръба за приложения при високи температури.

ASTM A813 347: Едношевна, единично или двойно заварена аустенитна тръба за приложения при висока температура и обща корозивност.

ASTM A814 347: Студено обработена заварена аустенитна тръба за висока температура и общо корозионно обслужване.

Химичен състав на тръбите от неръждаема стомана 347H

Механични свойства на тръба от неръждаема стомана 347H

Физически свойства на тръбите от неръждаема стомана 347H

Еквивалентни степени за тръба от неръждаема стомана 347H

Агрегацията на амилоид алфа-синуклеин (αS) е отличителен белег на болестта на Паркинсон и други синуклеинопатии.Напоследък тау протеинът, обикновено свързван с болестта на Алцхаймер, е свързан с αS патология и е установено, че се локализира съвместно в богати на αS включвания, въпреки че молекулярният механизъм на коагрегация на двата протеина остава неясен.Тук съобщаваме, че αS фазата се разделя на течни кондензати чрез електростатична комплексна кондензация с положително заредени полипептиди като тау.В зависимост от афинитета на αS към поликатиони и скоростта на изчерпване на валентността на коагулационната мрежа, съсиреците претърпяват бързо желиране или коалесценция, последвано от бавна амилоидна агрегация.Чрез комбиниране на набор от усъвършенствани биофизични техники, ние успяхме да характеризираме разделянето на фазата течност-течност αS/Tau и да идентифицираме ключовите фактори, които водят до образуването на хетерогенни агрегати, съдържащи и двата протеина в течен протеинов кондензат.
В допълнение към мембранните отделения, пространственото разделяне в клетките може да бъде постигнато и чрез образуването на богати на протеини, подобни на течност плътни тела, наречени биомолекулни кондензати или капчици, чрез процес, известен като разделяне на фаза течност-течност (LLPS).Тези капчици се образуват от многовалентни времеви взаимодействия, обикновено между протеини или протеини и РНК, и изпълняват различни функции в почти всички живи системи.Голям брой LLP-способни протеини показват последователности с ниска сложност, които са силно разстроени по природа и при образуването на биомолекулни кондензати 3, 4, 5.Многобройни експериментални изследвания разкриват гъвкавата, често неподредена и многовалентна природа на протеините, които изграждат тези течноподобни кондензати, въпреки че малко се знае за специфичните молекулни детерминанти, които контролират растежа и узряването на тези кондензати до по-твърдоподобни състояние..
Новите данни подкрепят хипотезата, че аберантният LLPS, управляван от протеини, и трансформацията на капчици в твърди структури могат да бъдат подходящи клетъчни пътища, водещи до образуването на неразтворими токсични агрегати, които често са отличителни белези на дегенеративни заболявания.Много LLPS-асоциирани вътрешно нарушени протеини (IDP), често силно заредени и гъвкави, отдавна са свързани с невродегенерация чрез процеса на амилоидна агрегация.По-специално, биомолекулни IDP кондензати като FUS7 или TDP-438 или протеини с големи домени с ниска сложност като hnRNPA19 са показали, че стареят в гелообразни или дори твърди форми чрез процес, наречен флуидизация.съединение.към преход в твърда фаза (LSPT) като функция на времето или в отговор на определени пост-транслационни модификации или патологично значими мутации1,7.
Друг IDP, свързан с LLPS in vivo, е Тау, асоцииран с микротубули нарушен протеин, чиято амилоидна агрегация е замесена в болестта на Алцхаймер 10, но също така наскоро е замесена в болестта на Паркинсон (PD) и други синаптични ядрени протеинопатии 11, 12, 13 са свързани.Доказано е, че тау спонтанно се дисоциира от разтвор/цитоплазма поради благоприятни електростатични взаимодействия14, което води до образуването на обогатени с тау капчици, известни като електростатични коацервати.Също така се наблюдава, че този тип неспецифично взаимодействие е движещата сила зад много биомолекулни кондензати в природата15.В случай на тау протеин, електростатичната агрегация може да се образува чрез проста агрегация, при която противоположно заредени области на протеина задействат процеса на разцепване, или чрез комплексна агрегация чрез взаимодействие с отрицателно заредени полимери като РНК.
Наскоро α-синуклеин (αS), амилоиден IDP, замесен в PD и други невродегенеративни заболявания, известни като синуклеинопатия 17, 18, е демонстриран в клетъчни и животински модели 19, 20, концентриран в протеинови кондензати с течноподобно поведение.Проучванията in vitro показват, че αS претърпява LLPS чрез просто агрегиране чрез предимно хидрофобни взаимодействия, въпреки че този процес изисква изключително високи протеинови концентрации и нетипично дълги времена на инкубация 19, 21.Дали кондензатите, съдържащи αS, наблюдавани in vivo, се образуват от този или други LLPS процеси, остава ключов неразрешен проблем.По подобен начин, въпреки че αS амилоидна агрегация е наблюдавана в неврони при PD и други синуклеинопатии, точният механизъм, чрез който αS претърпява вътреклетъчна амилоидна агрегация, остава неясен, тъй като свръхекспресията на този протеин изглежда не задейства този процес сама по себе си.Често е необходимо допълнително клетъчно увреждане, което предполага, че са необходими определени клетъчни места или микросреди за ренуклеацията на вътреклетъчните αS амилоидни групи.Една клетъчна среда, която е особено склонна към агрегация, може да бъде вътрешността на протеиновите кондензати 23.
Интересно е, че е установено, че αS и tau се локализират съвместно в характерни болестни включвания при хора с болестта на Паркинсон и други синуклеинопатии 24, 25 и експериментите съобщават за синергична патологична връзка между двата протеина 26, 27, което предполага потенциална връзка между агрегацията αS и тау при невродегенеративни заболявания.болест.Установено е, че αS и tau взаимодействат и насърчават взаимното агрегиране in vitro и in vivo 28, 29 и хетерогенни агрегати, съставени от тези два протеина, са наблюдавани в мозъците на пациенти със синуклеинопатии 30 .Въпреки това, малко се знае за молекулярната основа на взаимодействието между αS и tau и механизма на неговата ко-агрегация.Съобщава се, че αS взаимодейства с тау чрез електростатично привличане между силно отрицателно заредената С-терминална област на αS и централната богата на пролин област на тау, която също е обогатена с положително заредени остатъци.
В това изследване ние показваме, че αS наистина може да се дисоциира на капчици чрез кондензация на електростатичен комплекс в присъствието на тау протеин, за разлика от взаимодействието му с други положително заредени полипептиди като поли-L-лизин (pLK), и в този процес .αS действа като молекула на скелето за капковата мрежа.Ние идентифицирахме забележими разлики в процеса на узряване на електростатични αS коацервати, които са свързани с разликите в валентността и силата на взаимодействието на протеините, участващи в коацерватната мрежа.Интересното е, че наблюдавахме ко-агрегация на αS и тау амилоидни протеини в дълготрайни течни коацервати и идентифицирахме някои ключови фактори, които водят до ко-агрегация на тези два протеина в такива коацервати.Тук ние описваме подробно този процес, който е възможен молекулярен механизъм, лежащ в основата на колокализацията на два протеина в специфични за болестта включвания.
αS има силно анионна С-терминална опашка при неутрално рН (фиг. 1а) и ние предположихме, че може да претърпи LLPS чрез кондензация на електростатични комплекси с поликатионни неподредени полипептидни молекули.Използвахме 100-остатъчен поли-L-лизин (pLK) като изходна моделна молекула поради неговата положително заредена и неподредена полимерна природа при неутрално рН 32. Първо потвърдихме, че pLK взаимодейства с Ct домейна на αS чрез ЯМР спектроскопия на разтвора (Фигура 1b), използвайки 13C/15N-белязан αS в присъствието на нарастващи моларни съотношения αS:pLK.Взаимодействието на pLK с Ct-домена на αS се проявява в смущения на химическото изместване и намаляване на интензитета на пика в тази област на протеина.Интересното е, че когато смесихме αS с pLK при концентрация на αS от прибл.5–25 µM в присъствието на полиетилен гликол (5–15% PEG-8) (типичен LLPS буфер: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) незабавно преминахме през широко поле на образуване на протеини .капчици се наблюдават с помощта на флуоресцентна (WF) и микроскопия в светло поле (BF) (фиг. 1c).1-5 µm капчици, съдържащи концентриран αS (добавен 1 µM AlexaFluor488-белязан αS, AF488-αS), техните електростатични свойства могат да бъдат получени от тяхната устойчивост към 10% 1,6-хександиол (1,6-HD) и неговата чувствителност към повишаване на концентрацията на NaCl (фиг. 1в).Подобната на течност природа на коацерватите на електростатичния комплекс αS/pLK се демонстрира от способността им да се сливат в рамките на милисекунди (фиг. 1d).Използвайки турбидиметрия, ние количествено определихме образуването на капчици при тези условия, потвърдихме електростатичния характер на основното взаимодействие, свързано с неговата стабилност (фиг. 1e), и оценихме ефекта на различни полимерни съотношения върху процеса LLPS (фиг. 1f).Въпреки че образуването на капки се наблюдава в широк диапазон от полимерни съотношения, процесът е много благоприятен, когато pLK е в излишък от αS.LLPs също са наблюдавани при използване на химически различен изместващ агент декстран-70 (70 kDa) или използване на различни формати на проби, включително капки от стъклени предметни стъкла, ямки на микроплака от различни материали, Eppendorf или кварцови капиляри.
Схематично представяне на различни протеинови региони в WT-αS и ΔCt-αS вариантите, използвани в това изследване.Амфипатичният N-терминален домен, хидрофобният амилоид-образуващ (NAC) регион и отрицателно зареденият С-терминален домен са показани съответно в синьо, оранжево и червено.Показана е картата на нетната такса за остатък (NCPR) на WT-αS.b NMR анализ на взаимодействието αS/pLK в отсъствието на макромолекулни бучки.Тъй като концентрацията на pLK се увеличава (αS:pLK моларни съотношения от 1:0,5, 1:1,5 и 1:10 са показани съответно в светлозелено, зелено и тъмнозелено).c Коацерват αS/pLK (моларно съотношение 1:10) при 25 µM (1 µM AF488-белязан αS или Atto647N-белязан pLK за WF изображения) в LLPS буфер (горе) или допълнен с 500 mM NaCl (долу вляво) или след 10 % 1,6-хександиол (1,6-HD; долу вдясно).Скала = 20 µm.d Представителни микроскопични изображения на BF сливане на капчици на αS/pLK (моларно съотношение 1:10) при концентрация от 25 μM;стрелките показват сливането на отделни капки (червени и жълти стрелки) в нова капка (оранжева стрелка) в рамките на 200 ms).Скала = 20 µm.e Разсейване на светлината (при 350 nm) αS/pLK агрегация в LLPS буфер преди и след добавяне на 500 mM NaCl или 10% 1,6-HD при 25 µM αS (N = 3 повторения на пробата, средната стойност и стандартното отклонение също са посочени).f BF изображение (отгоре) и анализ на разсейване на светлината (при 350 nm, отдолу) на αS/pLK агрегация при 25 μM αS с нарастващо моларно съотношение αS:pLK (N = 3 повторения на пробата, средно и стандартно отклонение също са посочени).Мащабна лента = 10 µm.Лентата на мащаба на едно изображение показва мащаба на всички изображения в един панел.Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
Въз основа на нашите наблюдения на αS/pLK електростатична комплексна кондензация и предишни наблюдения на αS като клиентска молекула на тау/РНК кондензата чрез директно взаимодействие с tau31, ние предположихме, че αS и tau могат да се сегрегират съвместно с разтворителя в отсъствието на РНК кондензация.чрез електростатични комплекси, а αS е протеинът на скелето в αS/Tau коацервати (вижте разпределението на тау заряда на Фигура 2e).Ние наблюдавахме, че когато 10 μM αS и 10 μM Tau441 (съдържащи съответно 1 μM AF488-αS и 1 μM Atto647N-Tau) бяха смесени заедно в LLPS буфер, те лесно образуваха протеинови агрегати, съдържащи и двата протеина, както се вижда от WF микроскопия.(фиг. 2а).Колокализацията на двата протеина в капчиците се потвърждава чрез конфокална (CF) микроскопия (допълнителна фигура 1а).Подобно поведение се наблюдава, когато декстран-70 се използва като агрегиращ агент (допълнителна фигура 1с).Използвайки или FITC-белязан PEG, или декстран, открихме, че и двата агента за струпване са равномерно разпределени в пробите, като не показват нито сегрегация, нито асоциация (допълнителна фигура 1d).По-скоро предполага, че в тази система те насърчават разделянето на фазите чрез ефекти на макромолекулно струпване, тъй като PEG е преференциално стабилен агент за струпване, както се вижда в други системи за LLP 33, 34.Тези богати на протеини капчици са чувствителни към NaCl (1 М), но не и към 1,6-HD (10% v/v), потвърждавайки техните електростатични свойства (допълнителна фигура 2a, b).Тяхното течно поведение беше потвърдено чрез наблюдение на събития на сливане на капчици за милисекунди с помощта на BF микроскопия (Фиг. 2b).
a Конфокални (CF) микроскопски изображения на αS/Tau441 коацервати в LLPS буфер (10 μM от всеки протеин, 0,5 μM от AF488-белязан αS и Atto647N-белязан Tau441).b Представителни изображения на диференциален интерферентен контраст (DIC) на събития на сливане на капчици αS/Tau441 (10 μM за всеки протеин).c Фазова диаграма на базата на разсейване на светлината (при 350 nm) на Tau441 LLPS (0–15 µM) в отсъствие (вляво) или присъствие (вдясно) на 50 µM αS.По-топлите цветове показват повече разпръскване.d Разсейване на светлината на αS/Tau441 LLPS проби с нарастваща концентрация на αS (Tau441 при 5 µM, N = 2–3 повторения на пробата, както е посочено).e Схематично представяне на някои варианти на тау протеин и различни региони на протеина, използвани в това изследване: отрицателно зареден N-терминален домен (червен), богат на пролин регион (син), микротубулен свързващ домен (MTBD, подчертан в оранжево) и двойна спирала, образуваща амилоид.участъци с нишка (PHF), разположени в рамките на MTBD (сиво).Показана е картата на Net Charge Per Residue (NCPR) на Tau441.f Използвайки 1 µM AF488-белязан αS и Atto647N-маркиран ΔNt-, използвайки 1 µM AF488-маркиран αS или ΔCt-αS в присъствието на ΔNt-Tau (отгоре, 10 µM на протеин) или K18 (отдолу, 50 µM на протеин ) ) ) микрографии на WF, кондензиран в LLPS или K18 буфер.Мащабните ленти в едно изображение представляват мащаба на всички изображения в един панел (20 µm за панели a, b и f).Суровите данни за панели c и d се предоставят като файлове с необработени данни.
За да тестваме ролята на αS в този процес на LLPS, първо изследвахме ефекта на αS върху стабилността на капките чрез нефелометрия, използвайки нарастващи концентрации на NaCl (фиг. 2в).Колкото по-висока е концентрацията на сол в пробите, съдържащи αS, толкова по-високи са стойностите на разсейване на светлината (при 350 nm), което показва стабилизиращата роля на αS в тази LLPS система.Подобен ефект може да се наблюдава чрез увеличаване на концентрацията на αS (и следователно съотношението αS:Tau441) до приблизително.10-кратно увеличение спрямо концентрацията на тау (5 µM) (фиг. 2d).За да демонстрираме, че αS е скелетен протеин в коацервати, ние решихме да изследваме поведението на LLPS-разрушения Тау мутант, който няма отрицателно заредена N-терминална област (остатъци 1–150, виж Фиг. 2e), наречена ΔNt-Tau.WF микроскопията и нефелометрията потвърдиха, че самият ΔNt-Tau не е претърпял LLPS (фиг. 2f и допълнителна фигура 2d), както беше съобщено по-рано 14. Въпреки това, когато αS беше добавен към дисперсионни разтвори на този пресечен вариант на Tau, процесът на LLPS беше напълно възстановен с плътност на капките, близка до плътността на капките на пълноразмерни разтвори на Tau и αS при подобни условия и протеинови концентрации.Този процес може да се наблюдава и при условия на ниско макромолекулно струпване (допълнителна фигура 2с).Ролята на С-терминалния αS регион, но не на цялата му дължина, в LLPS процеса беше демонстрирана чрез инхибиране на образуването на капчици, използвайки С-терминален пресечен αS вариант, лишен от остатъци 104–140 (Фиг. 1а) на (ΔCt- αS) протеин (фиг. 2f и допълнителна фигура 2d).Колокализацията на αS и ΔNt-Tau беше потвърдена чрез конфокална флуоресцентна микроскопия (допълнителна фигура 1b).
За по-нататъшно тестване на механизма LLPS между Tau441 и αS беше използван допълнителен вариант на Tau, а именно фрагментът на сдвоеното сърцевина на спирална нишка (PHF) в домейна за свързване на микротубули (MTBD), който, ако съдържа четири характерни повтарящи се домена, обикновено известни също като фрагмента K18 (виж Фиг. 2e).Наскоро беше съобщено, че αS преференциално се свързва с тау протеин, разположен в богат на пролин домен в последователност, която предшества домейна, свързващ микротубулите.Въпреки това, PHF регионът също е богат на положително заредени остатъци (вижте Фигура 2е), особено лизин (15% остатъци), което ни накара да проверим дали този регион също допринася за кондензацията на αS/Tau комплекса.Ние наблюдавахме, че K18 сам по себе си не може да задейства LLPS при концентрации до 100 μM при тестваните условия (LLPS буфер с 15% PEG или 20% декстран) (Фигура 2f).Въпреки това, когато добавихме 50 µM αS към 50 µM K18, бързо образуване на протеинови капчици, съдържащи K18 и αS, се наблюдава чрез нефелометрия (допълнителна фигура 2d) и WF микроскопия (фиг. 2f).Както се очакваше, ΔCt-αS не успя да възстанови поведението на LLPS на K18 (фиг. 2f).Отбелязваме, че агрегацията на αS/K18 изисква малко по-високи протеинови концентрации, за да индуцира LLPS в сравнение с αS/ΔNt-Tau или αS/Tau441, при равни други условия.Това е в съответствие с по-силно взаимодействие на αS С-терминалния участък с богатия на пролин Tau домейн в сравнение с микротубулно-свързващия домен, както е описано по-рано 31 .
Като се има предвид, че ΔNt-Tau не може да изпълнява LLPS в отсъствието на αS, ние избрахме този вариант на Tau като модел за характеризиране на αS/Tau LLPS предвид неговата простота в LLPS системи с Tau с пълна дължина (изотип, Tau441/Tau441).със сложни (хетеротипни, αS/Tau441) процеси на агрегация.Ние сравнихме степента на агрегация на αS (като част от протеина на кондензираната фаза, fαS,c) в системите αS/Tau и αS/ΔNt-Tau чрез центрофугиране и SDS-PAGE анализ на дисперсна фаза (виж 2e), открихме много сходни стойности за всички протеини в еднаква концентрация.По-специално, ние получихме fαS,c 84 ± 2% и 79 ± 7% съответно за αS/Tau и αS/ΔNt-Tau, което предполага, че хетеротипното взаимодействие между αS и tau е по-добро от взаимодействието между тау молекули.между.
Взаимодействието с различни поликатиони и ефектът от процеса на кондензация върху кинетиката на αS бяха изследвани за първи път чрез метода за възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелване (FRAP).Тествахме αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau и αS/pLK коацервати (100 μM αS, допълнен с 2 μM αS AF488-αS и 100 μM Tau441 или ΔNt-Tau или 1 mM pLK).Данните са получени през първите 30 минути след смесване на компонентите на пробата.От представителни FRAP изображения (Фиг. 3a, αS/Tau441 кондензация) и съответните им криви на времето (Фиг. 3b, Допълнителна фигура 3), може да се види, че αS кинетиката е много подобна на тази на Tau441 коацервати.и ΔNt-Tau, което е много по-бързо с pLK.Изчислените коефициенти на дифузия за αS вътре в коацервата съгласно FRAP (както е описано от Kang et al. 35) са D = 0,013 ± 0,009 µm2/s и D = 0,026 ± 0,008 µm2/s за αS/Tau441 и αS/ΔNt- за системата αS/.pLK, Tau и D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, съответно (фиг. 3c).Въпреки това коефициентът на дифузия αS в дисперсната фаза е с няколко порядъка по-висок от всички кондензирани фази, както е определено чрез флуоресцентна корелационна спектроскопия (FCS, вижте допълнителна фигура 3) при същите условия (LLPS буфер), но в отсъствието на поликатиони (D = 8 ± 4 µm2/s).Следователно, кинетиката на транслацията на αS е значително намалена в коацервати в сравнение с протеини в дисперсната фаза поради изразени ефекти на молекулярно струпване, въпреки че всички коацервати запазват подобни на течност свойства през първия половин час след образуването им, за разлика от тау фазата.по-бърза кинетика в pLK кондензат.
a – c FRAP анализ на αS динамиката (2% AF488-белязан αS) в електростатични коацервати.Представителни изображения на αS/Tau441 FRAP анализи в три екземпляра са показани в (а), където червените кръгове показват обезцветени области.Скалата е 5 µm.b Средни FRAP криви и (c) изчислени коефициенти на дифузия (D) за 5–6 (N) различни капчици от три експеримента, използващи 100 µM αS и еквимоларни концентрации на Tau441 (червено) или ΔNt-Tau (синьо) или pLK (зелено) при десет пъти концентрацията на LLPS.Стандартното отклонение на кривата FRAP е показано в щрихиран цвят.За сравнение, коефициентът на дифузия αS в дисперсната фаза се определя трикратно с помощта на флуоресцентна корелационна спектроскопия (FCS) (вижте допълнителна фигура 3 и методи за повече информация).d Непрекъснати EPR спектри на X-лента от 100 μM TEMPOL-122-αS в LLPS буфер без никакъв поликатион (черен) или в присъствието на 100 μM Tau441 (червен) или ΔNt-Tau (син) или 1 mM pLK (зелен).Вмъкването показва увеличен изглед на силните полеви линии, където се случват най-драматичните промени.e Криви на свързване на 50 μM TEMPOL-122-αS с различни поликатиони в отсъствието на LLPS (без PEG).Показано е, че намалената амплитуда на лента III в сравнение с лента II (IIII/III) на нормализирания EPR спектър увеличава моларните съотношения на Tau441 (червено), ΔNt-Tau (синьо) и pLK (зелено).Цветните линии показват съответствие с данните, използвайки груб модел на свързване с n идентични и независими места на свързване на всяка крива.Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
Като допълнение, ние изследвахме динамиката на αS в различни коацервати, използвайки насочено спиново маркиране (SDSL) и непрекъснат електронен парамагнитен резонанс (CW-EPR).Този метод се оказа много полезен при отчитане на гъвкавостта и динамиката на IDP с реалистична остатъчна резолюция36,37,38.За тази цел конструирахме цистеинови остатъци в единични Cys мутанти и използвахме 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) спин сонда.Малеимидни производни ги обозначават.По-конкретно, вмъкнахме сонди TEMPOL на позиция 122 или 24 αS (TEMPOL-122-αS и TEMPOL-24-αS).В първия случай ние се насочваме към С-терминалната област на протеина, която участва във взаимодействието с поликатиони.Вместо това, позиция 24 може да ни даде информация за цялостната динамика на протеините в кондензата.И в двата случая получените EPR сигнали за протеини от дисперсната фаза съответстват на нитроксидни радикали в бързо движещо се състояние.След разделяне на фазите в присъствието на tau или pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 или ΔNt-Tau в съотношение 1:1 или pLK в съотношение 1:10), се наблюдава увеличение на относителния пиков интензитет в спектърът на EPR на αS.Линията на загуба се разшири, което показва намалена кинетика на преориентация на αS в капчици в сравнение с протеин в разредена фаза (фиг. 3d, допълнителна фигура 4а).Тези промени са по-изразени в позиция 122. Докато в позиция 24 присъствието на pLK не повлия на кинетиката на сондата, в позиция 122 формата на спектралната линия се промени значително (допълнителна фигура 4а).Когато се опитахме да моделираме спектрите в позиция 122 на две αS/поликационни системи, използвайки изотропния модел (допълнителна фигура 5а), който обикновено се използва за описание на динамиката на белязан със спин IDP38, 39, не успяхме да реконструираме експерименталните спектри..Спектрална симулация на позицията на 24 завъртания контрастира (допълнителна фигура 5а).Това предполага, че има преференциални позиции в пространството на спинови конфигурации на С-терминалната област на αS в присъствието на поликатиони.При разглеждане на фракцията на αS в кондензираната фаза при експериментални EPR условия (84 ± 2%, 79 ± 7% и 47 ± 4% съответно за αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau и αS/pLK – вижте Допълнителен Фиг. 2e от анализ на данни c), може да се види, че разширяването, открито чрез EPR метода, отразява главно взаимодействието на С-терминалната област на αS с различни поликатиони в кондензираната фаза (основната промяна при използване на TEMPOL-122- αS), а не протеинова кондензация.В сондата се наблюдава повишаване на микровискозитета.Както се очакваше, EPR спектърът на протеина при условия, различни от LLPS, беше напълно възстановен, когато към сместа беше добавен 1 М NaCl (допълнителна фигура 4b).Като цяло, нашите данни предполагат, че промените, открити от CW-EPR, отразяват главно взаимодействието на С-терминалната област на αS с различни поликатиони в кондензираната фаза и това взаимодействие изглежда по-силно с pLK, отколкото с Tau.
За да получим повече структурна информация за протеините в коацервата, решихме да проучим системата LLPS, използвайки NMR в разтвор.Въпреки това, можем да открием само αS фракцията, оставаща в дисперсната фаза, което може да се дължи на намалена динамика на протеина вътре в коацервата и плътна фаза на дъното на разтвора в NMR анализ.Когато анализирахме структурата и динамиката на протеина, оставащ в дисперсната фаза на LLPS пробата, използвайки NMR (допълнителна фигура 5c, d), забелязахме, че протеинът се държи почти идентично в присъствието на pLK и ΔNt-Tau, и двете от които са във вторична структура и динамика на протеиновия скелет, разкрити чрез експерименти за вторично химическо изместване и R1ρ релаксация.Данните от NMR показват, че С-краят на αS претърпява значителна загуба на конформационна гъвкавост, като същевременно запазва своята неподредена природа, подобно на останалата част от протеиновата последователност, поради нейните взаимодействия с поликатиони.
Тъй като разширяването на CW-EPR сигнала, наблюдавано в кондензираната фаза на TEMPOL-122-αS, отразява взаимодействието на протеина с поликатиони, ние извършихме EPR титруване, за да оценим афинитета на свързване на αS към различни поликатиони в отсъствието на LLPS (без натрупване на Buffer LLPS), което предполага, че взаимодействията са еднакви в разредени и концентрирани фази (което се потвърждава от нашите данни, Допълнителна Фигура 4а и Допълнителна Фигура 6).Целта беше да се види дали всички коацервати, въпреки техните общи свойства, подобни на течности, показват някакво диференциално поведение на молекулярно ниво.Както се очакваше, EPR спектърът се разшири с увеличаване на концентрацията на поликатион, отразявайки намаляване на молекулярната гъвкавост поради молекулярните взаимодействия на всички партньори за взаимодействие почти до насищане (фиг. 3e, допълнителна фигура 6).pLK постига това насищане при по-ниско моларно съотношение (поликатион: αS) в сравнение с ΔNt-Tau и Tau441.Всъщност сравнението на данните с приблизителен модел на свързване, приемайки n идентични и независими места на свързване, показа, че привидната константа на дисоциация на pLK (~5 μM) е с порядък по-ниска от тази на Tau441 или ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Въпреки че това е груба оценка, това предполага, че αS има по-висок афинитет към по-прости поликатиони с непрекъснати области с положителен заряд.Като се има предвид тази разлика в афинитета между αS и различни поликатиони, ние предположихме, че техните течни свойства могат да се променят по различен начин с времето и по този начин да страдат от различни LSPT процеси.
Като се има предвид силно пренаселената среда в протеиновия коацерват и амилоидната природа на протеина, ние наблюдавахме поведението на коацервата във времето, за да открием възможни LSPT процеси.Използвайки BF и CF микроскопия (Фигура 4), наблюдавахме, че αS/Tau441 коацерва до голяма степен в разтвор, образувайки големи капчици, които контактуват и намокрят повърхността на дъното на ямката/предметното стъкло като пълни капчици, както се очаква (допълнителна фигура 7d);ние наричаме тези формирани от дъното структури „протеинови салове“.Тези структури остават течни, тъй като запазват способността си да се сливат (допълнителна фигура 7b) и могат да се видят няколко часа след задействането на LLPS (фиг. 4 и допълнителна фигура 7c).Ние наблюдавахме, че процесът на омокряне се предпочита на повърхността на хидрофилни, а не на хидрофобни материали (допълнителна фигура 7а), както се очаква за електростатични коацервати с небалансирани заряди и по този начин високи електростатични повърхностни потенциали.По-специално, коалесценцията и рафтингът на αS/ΔNt-Tau бяха значително намалени, докато кондензатите на αS/pLK бяха значително намалени (фиг. 4).По време на краткото време на инкубация, капчиците αS/pLK успяха да се слеят и намокрят хидрофилната повърхност, но този процес бързо спря и след 5 часа инкубация бяха наблюдавани само ограничени събития на коалесценция и никакво намокряне.– преход гел-капка.
Представителни BF (панели в скала на сивото) и CF (десни панели, AF488-белязан αS в зелено) на проби от коацерват, съдържащи 100 µM αS (1% флуоресцентен етикет) в LLPS буфер в присъствието на 100 µM Tau441 (горна) флуоресценция) микроскопични изображения ΔNt -Tau (център) или 1 mM pLK (отдолу) при различни инкубационни времена и фокусни височини (z, разстояние от дъното на гнездото на плаката).Експериментите се повтарят 4-6 пъти независимо един от друг със същите резултати.αS/Tau441 коацервати се намокрят след 24 часа, образувайки салове, по-големи от изображението.Мащабната лента за всички изображения е 20 µm.
След това попитахме дали големите течноподобни протеинови пулове, образувани в αS/Tau441 LLPS, биха довели до амилоидна агрегация на някой от изследваните протеини.Проследихме съзряването на капчици αS/Tau441 с течение на времето с WF микроскопия при същите условия, както по-горе, но използвайки 1 μM AF488-белязан αS и Atto647N-белязан Tau441 (фиг. 5а).Както се очакваше, наблюдавахме пълна локализация на протеина през целия процес на узряване.Интересното е, че от ок.След 5 часа бяха наблюдавани по-интензивни некръгли структури вътре в саловете, които нарекохме „точки“, някои от които бяха колокализирани с αS, а някои бяха обогатени с Tau441 (фиг. 5а, бели стрелки).Тези петна винаги са били наблюдавани в салове в по-голяма степен за αS/ΔNt-Tau, отколкото за αS/ΔNt-Tau.Нямаше отчетливи петна в капчиците на pLK и Tau системите, некомпетентни за сливане/омокряне.За да проверим дали тези петна, съдържащи αS и Tau441, са амилоид-подобни агрегати, ние проведохме подобен експеримент, използвайки CF микроскопия, в която Tau441 беше белязан с Atto647N и 12,5 μM амилоид-специфичен тиофлавин-T (ThT) беше добавен от самото начало.багрило.Въпреки че ThT-оцветяването на αS/Tau441 капчици или салове не се наблюдава дори след 24 часа инкубация (фиг. 5b, горен ред - оставащи капчици върху протеинови салове), ThT-позитивните структури, съдържащи Atto647N-Tau441 вътре в салове, бяха много слаби.това възпроизвежда размера, формата и местоположението на описаните по-рано петна (фиг. 5b, средни и долни редове), което предполага, че петната може да съответстват на подобни на амилоид агрегати, образувани в стареещи флуидни коацервати.
WF 25 μM αS при различни времена на инкубация и фокусни височини (z, разстояние от несвързаното дъно) в присъствието на 25 μM Tau441 (1 μM AF488-белязан αS и Atto647N-белязан Tau441) в ямка на микроскопска плака с LLPS буфер) .Шест експеримента бяха независимо повторени с подобни резултати.b CF микроскопско изображение на 25 μM αS в присъствието на 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-белязан Tau441) и 12,5 μM тиофлавин-T (ThT).Претеглените протеинови капки и отложените протеинови салове и петна са показани съответно в горния и средния ред.Долният ред показва изображения на салове и капки от 3 независими реплики.Белите стрелки показват ThT-положителни точки и в двата панела.Мащабната лента за всички изображения е 20 µm.
За да изследваме по-подробно промените в коацерватната протеинова мрежа по време на прехода от течно към твърдо състояние, използвахме флуоресцентно изобразяване през целия живот (FLIM) и резонансна енергийна трансферна микроскопия на Förster (FRET) (Фигура 6 и допълнителни фигури 8 и 9).Ние предположихме, че съзряването на коацервата на слоя в по-кондензирана или дори подобна на твърдо вещество агрегирана протеинова структура води до по-близък контакт между протеина и флуоресцентната сонда, прикрепена към него, потенциално предизвиквайки ефект на охлаждане, проявяващ се в съкратен живот на сондата (τ) , както е описано по-рано40.,41 ,42.В допълнение, за двойно белязани проби (AF488 и Atto647N като FRET донорни и акцепторни багрила, съответно), това намаление на τ може също да бъде придружено от коацерватна кондензация и повишаване на ефективността на FRET (E) по време на LSPT.Наблюдавахме образуването на плотове и петна с течение на времето в LLPS αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau проби (25 µM от всеки протеин в LLPS буфер, съдържащ 1 µM AF488, белязан с αS и/или Atto647N, белязан с Tau441 или ΔNt-Tau).Наблюдавахме обща тенденция в това, че животът на флуоресценцията на сондите AF488 (τ488) и Atto647N (τ647N) намалява леко с узряването на коацерватите (фиг. 6 и допълнителна фигура 8c).Интересното е, че тази промяна е значително подобрена за точки в салове (фиг. 6c), което показва, че по-нататъшна протеинова кондензация е настъпила в точки.В подкрепа на това не се наблюдава значителна промяна в живота на флуоресценцията за капчици αS/ΔNt-Tau, остарели в продължение на 24 часа (допълнителна фигура 8d), което предполага, че желирането на капчици е процес, различен от петна и не е придружен от значителна молекулярна реорганизация в рамките на коацервати.Трябва да се отбележи, че точките имат различни размери и променливо съдържание в αS, особено за системата αS / Tau441 (допълнителна фигура 8e).Намаляването на живота на флуоресценцията на място беше придружено от увеличаване на интензитета, особено за Atto647N, означен с Tau441 (допълнителна фигура 8а), и по-висока ефективност на FRET както за системите αS/Tau441, така и за αS/ΔNt-Tau, което показва допълнителна кондензация в LLPS Пет часа след задействане, протеините вътре в статичното електричество се кондензираха.В сравнение с αS/ΔNt-Tau, наблюдавахме по-ниски стойности на τ647N и малко по-високи стойности на τ488 в петна αS/Tau441, придружени от по-ниски и по-нехомогенни стойности на FRET.Вероятно това може да е свързано с факта, че в системата αS/Tau441 наблюдаваното и очаквано изобилие на αS в агрегатите е по-хетерогенно, често субстехиометрично в сравнение с Tau, тъй като самият Tau441 може също да претърпи LLPS и агрегация (допълнителна фигура 8e) .Въпреки това, степента на коалесценция на капчици, образуването на сала и, което е важно, агрегацията на протеини в подобни на течности коацервати е максимална, когато присъстват както Tau441, така и αS.
изображения с флуоресцентна микроскопия (FLIM) на αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau при 25 μM от всеки протеин (1 μM AF488-белязан αS и 1 μM Atto647N-белязан Tau441 или ΔNt-Tau) в LLPS буфер.Колоните показват представителни изображения на проби от LLPS при различни времена на зреене (30 минути, 5 часа и 24 часа).Червената рамка показва областта, съдържаща петна αS/Tau441.Продължителността на живота е показана като цветни ленти.Мащабна лента = 20 µm за всички изображения.b Увеличено FLIM изображение на избраната област, показано в червеното поле в панел a.Диапазоните на живота са показани с помощта на същата цветова скала като в панел a.Мащабна лента = 5 µm.c Хистограми, показващи AF488 (прикрепен към αS) или Atto647N (прикрепен към Tau) за различни протеинови видове (капчици-D-, raft-R- и speckle-P), идентифицирани в FLIM изображения, записани за αS-) времеви разпределения, живот на Tau441 и Проби от αS/ΔNt-Tau коацерват (N = 17-32 ROI за D, 29-44 ROI за R и 21-51 ROI за точки).Средните и средните стойности са показани съответно като жълти квадратчета и черни линии вътре в кутиите.Долната и горната граница на кутията представляват съответно първия и третия квартил, а минималните и максималните стойности в рамките на 1,5-кратния интерквартилен диапазон (IQR) са показани като мустаци.Отклоненията са показани като черни диаманти.Статистическата значимост между двойки разпределения се определя с помощта на t-тест за две проби, като се приемат неравни вариации.Двустранен t-тест p-стойности са показани със звездички за всяка двойка сравнени данни (* p-стойност > 0,01, ** p-стойност > 0,001, *** p-стойност > 0,0001, **** p-стойност > 0,00001), ns Показва незначителност (p-стойност > 0,05).Точните стойности на p са дадени в допълнителна таблица 1, а оригиналните данни са представени като необработени файлове с данни.
За по-нататъшно демонстриране на амилоидоподобната природа на петна/агрегати, ние третирахме неоцветени коацерватни проби в продължение на 24 часа с високи концентрации на (1 М) NaCl, което доведе до отделяне на агрегати от протеинови коацервати.Когато се наблюдават изолирани агрегати (т.е. диспергиран разтвор на агрегати) с помощта на атомно-силова микроскопия (AFM), наблюдаваме предимно сферична морфология с правилна височина от около 15 nm, която има тенденция да се свързва при условия на висока концентрация на сол, подобно на поведението на типичните амилоидни фибрили поради силния хидрофобен ефект върху повърхността (обърнете внимание, че фибрилите обикновено имат височина от ~ 10 nm) (допълнителна фигура 10а).Интересно е, че когато изолираните агрегати бяха инкубирани с ThT в стандартен ThT флуоресцентен анализ, ние наблюдавахме драматично увеличение на квантовия добив на ThT флуоресценция, сравнимо с наблюдаваното, когато багрилото беше инкубирано с типични αS амилоидни фибрили (допълнителна фигура 10b), което предполага, че коацерватните агрегати съдържат подобни на амилоид структури..Всъщност, агрегатите са толерантни към високи концентрации на сол, но чувствителни към 4 М гуанидин хлорид (GdnHCl), като типичните амилоидни фибрили (допълнителна фигура 10с).
След това анализирахме състава на агрегатите, използвайки флуоресценция на единична молекула, специфична флуоресцентна корелационна/кръстосана корелационна спектроскопия (FCS/FCCS) и анализ на избухване на откриване на двуцветно съвпадение (TCCD).За тази цел изолирахме агрегати, образувани след 24 часа инкубация в 100 μl LLPS проби, съдържащи αS и Tau441 (и двете 25 μM) заедно с 1 μM AF488-белязан αS и 1 μM Atto647N-белязан Tau441.Разредете получения разтвор на диспергиран агрегат до мономолекулно състояние, като използвате същия буфер без PEG и 1 М NaCl (същият буфер, използван за отделяне на агрегати от коацерват), за да предотвратите всички възможни електростатични взаимодействия между LLPS и протеина.Пример за времевата траектория на една молекула може да се види на фиг. 7а.FCCS/FCS анализ (кръстосана корелация, CC и автокорелация, AC) показа, че агрегатите, съдържащи αS и tau, са изобилни в пробите (вижте CC кривата на Фиг. 7b, ляв панел) и излишъкът от остатъчен мономерен протеин възниква като резултат от процеса на разреждане (вижте AC кривите на фигура 7b, ляв панел).Контролните експерименти, извършени при същите условия на разтвор, като се използват проби, съдържащи само мономерни протеини, не показват CC криви, а AC кривите се вписват добре в еднокомпонентния дифузионен модел (Уравнение 4), където мономерните протеини имат очакваните коефициенти на дифузия (Фиг. 7b ), десен панел).Коефициентът на дифузия на агрегираните частици е по-малък от 1 µm2/s, а този на мономерните протеини е около 1 µm2/s.50–100 µm/s;стойностите са подобни на публикуваните преди това стойности за обработени с ултразвук αS амилоидни фибрили и мономерен αS поотделно при подобни условия на разтвора44.Когато анализирахме агрегатите с TCCD анализ на експлозия (фиг. 7c, горен панел), открихме, че във всеки изолиран агрегат (αS/Tau хетероагрегат), около 60% от откритите агрегати съдържат както αS, така и тау, около 30% съдържат само tau, само около 10% αS.Стехиометричният анализ на αS/Tau хетероагрегатите показа, че повечето от хетероагрегатите са обогатени с tau (стехиометрия под 0,5, средният брой тау молекули на агрегат е 4 пъти повече от αS молекули), което е в съответствие с нашата работа, наблюдавана в FLIM in situ експерименти..FRET анализът показа, че тези агрегати съдържат и двата протеина, въпреки че действителните стойности на FRET в този случай не са от голямо значение, тъй като разпределението на флуорофорите във всеки агрегат е случайно поради излишък от небелязан протеин, използван в експеримента.Интересното е, че когато извършихме същия анализ, използвайки 45, 46 зряла амилоидна агрегация с дефицит на Tau вариант (вижте допълнителна фигура 11a, b), забелязахме, че въпреки че αS електростатичната агрегация беше същата (допълнителна фигура 11c, d), способността за образуване на агрегати в рамките на коацервата беше драстично намалена и FLIM откри няколко петна в in situ експерименти и бяха наблюдавани слаби криви на кръстосана корелация за изолирани проби от агрегати.Въпреки това, за малък брой открити агрегати (само една десета от Tau441), наблюдавахме, че всеки агрегат е обогатен на αS в сравнение с този вариант на Tau, като приблизително 50% от откритите агрегати съдържат само αS молекули, а αS е хетерогенен в излишък .агрегати (вижте допълнителна фигура 11e), за разлика от хетерогенните агрегати, генерирани от Tau441 (фиг. 6f).Резултатите от тези експерименти показват, че въпреки че самият αS е способен да се натрупва с тау в коацервата, нуклеацията на тау е по-благоприятна при тези условия и получените амилоид-подобни агрегати могат да действат като форма на αS и тау.Въпреки това, след като се образува богато на тау ядро, хетеротипните взаимодействия между αS и тау са предпочитани в агрегатите пред хомотипните взаимодействия между тау молекулите;ние също наблюдаваме протеинови мрежи в течни αS/tau коацервати.
a Представителни флуоресцентни времеви следи на единични молекули от изолирани агрегати, образувани в αS/Tau441 електростатични коацервати.Изблици, съответстващи на αS/Tau441 коагрегати (избухвания над посочения праг) бяха наблюдавани в три канала за откриване (AF488 и Atto647N емисия след директно възбуждане, сини и червени линии, Atto647N емисия след индиректно възбуждане), FRET, виолетова линия).b FCS/FCCS анализ на проба от изолирани αS/Tau441 агрегати, получени от LLPS (ляв панел).Кривите на автокорелация (AC) за AF488 и Atto647N са показани съответно в синьо и червено, а кривите на кръстосана корелация (CC), свързани с агрегати, съдържащи двете багрила, са показани в лилаво.AC кривите отразяват присъствието на белязани мономерни и агрегирани протеинови видове, докато CC кривите показват само дифузията на двойно белязани агрегати.Същият анализ, но при същите условия на разтвор, както в изолирани петна, проби, съдържащи само мономерни αS и Tau441, са показани като контроли в десния панел.c Флаш анализ на флуоресценция на единични молекули от изолирани агрегати, образувани в електростатични коацервати αS/Tau441.Информацията за всеки агрегат, открит в четири различни повторения (N = 152), е начертана спрямо тяхната стехиометрия, S стойности и FRET ефективност (горният панел, цветната лента отразява появата).Могат да се разграничат три типа агрегати: -αS-само агрегати с S~1 и FRET~0, Tau-само агрегати с S~0 и FRET~1 и хетерогенни Tau/αS агрегати с междинни S и FRET Оценки на количеството на двата маркерни протеина, открити във всеки хетерогенен агрегат (N = 100), са показани в долния панел (цветната скала отразява появата).Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
Съзряването или стареенето на течните протеинови кондензати в гелообразни или твърди структури с течение на времето се съобщава, че участва в няколко физиологични функции на кондензата47, както и в заболяване, като анормален процес, предшестващ амилоидната агрегация 7, 48, 49. Тук ние изучаваме разделянето на фазите и поведението в детайли.LSPT αS в присъствието на произволни поликатиони в контролирана среда при ниски микромоларни концентрации и физиологично релевантни условия (имайте предвид, че изчислената физиологична концентрация на αS е >1 µM50), следвайки типичното термодинамично управлявано поведение на LPS.Открихме, че αS, който съдържа силно отрицателно заредена С-терминална област при физиологично рН, е в състояние да образува богати на протеини капчици във воден разтвор чрез LLPS в присъствието на силно катионни неподредени пептиди като pLK или Tau чрез процес на електростатично сложна кондензация в присъствието на агрегационни макромолекули.Този процес може да има съответни ефекти в клетъчната среда, където αS среща различни поликатионни молекули, свързани с агрегацията, свързана с болестта, както in vitro, така и in vivo 51, 52, 53, 54.
В много проучвания динамиката на протеина в капчиците се счита за един от ключовите фактори, определящи процеса на съзряване 55, 56.В електростатичните αS коацервати с поликатиони, процесът на узряване очевидно зависи от силата на взаимодействията с поликатиони, валентността и множеството на тези взаимодействия.Теорията на равновесието предполага, че равновесен пейзаж от две течни състояния би бил наличието на голяма капчица, богата на биополимери, които задвижват LLPS57,58.Растежът на капките може да бъде постигнат чрез узряване на Ostwald59, коалесценция60 или консумация на свободен мономер в дисперсната фаза61.За αS и Tau441, ΔNt-Tau или pLK, по-голямата част от протеина се концентрира в кондензата при условията, използвани в това изследване.Въпреки това, докато тау капчиците в пълен размер се сливат бързо при повърхностно намокряне, коалесценцията и намокрянето на капчиците са трудни за ΔNt-Tau и pLK, което предполага бърза загуба на течни свойства в тези две системи.Според нашия FLIM-FRET анализ, остарелите pLK и ΔNt-Tau капчици показват подобна степен на протеинова агрегация (подобен живот на флуоресценция) като оригиналните капчици, което предполага, че оригиналната протеинова мрежа е запазена, макар и по-твърда.
Ние рационализираме нашите експериментални резултати в следния модел (Фигура 8).Първоначално временно образуваните капчици често са протеинови мрежи без електростатична компенсация и по този начин има области на дисбаланс на заряда, особено на интерфейса на капчиците, което води до капчици с висок електростатичен повърхностен потенциал.За компенсиране на заряда (явление, обикновено наричано изчерпване на валентността) и минимизиране на повърхностния потенциал на капчиците, капчиците могат да включват нови полипептиди от разредената фаза, да реорганизират протеиновите мрежи, за да оптимизират взаимодействията заряд-заряд и да взаимодействат с други капчици.с повърхности (мокрене).Капчиците αS/pLK, поради тяхната по-проста протеинова мрежа (само хетеротипни взаимодействия между αS и pLK) и по-голям афинитет към взаимодействия протеин-протеин, изглежда са в състояние да балансират заряда на кондензата по-бързо;наистина, ние наблюдавахме по-бърза протеинова кинетика в първоначално образуваните αS/pLK коацервати, отколкото в αS/Tau.След изчерпване на валентността взаимодействията стават по-малко ефимерни и капчиците губят течните си свойства и се превръщат в гелообразни, незапалими капчици с нисък електростатичен повърхностен потенциал (и следователно неспособни да намокрят повърхността).За разлика от това, капчиците αS/Tau са по-малко ефективни при оптимизиране на баланса на заряда на капките поради по-сложни протеинови мрежи (както с хомотипни, така и с хетеротипни взаимодействия) и по-слабия характер на протеиновите взаимодействия.Това води до капчици, които запазват течно поведение за продължителни периоди от време и показват висок електростатичен повърхностен потенциал, който има тенденция да бъде сведен до минимум чрез сливане и растеж (като по този начин минимизира съотношението повърхностна площ/обем на капките) и чрез намокряне на хидрофилната повърхностна химия.Това създава големи концентрирани протеинови библиотеки, които запазват течните свойства, тъй като взаимодействията остават много преходни поради постоянното търсене на оптимизация на заряда в протеиновата мрежа.Интересно е, че N-терминално пресечените форми на Тау, включително някои естествено срещащи се изоформи62, показват междинно поведение, като някои коацервати стареят с αS в дълготрайни гелообразни капчици, докато други се трансформират в големи течни кондензати.Тази двойственост в съзряването на αS електростатични коацервати е в съответствие с последните теоретични и експериментални проучвания на LLPS, които идентифицират корелация между изчерпването на валентността и електростатичното пресяване в кондензатите като ключ за контролиране на размера на кондензата и свойствата на течността.Механизъм 58.61.
Тази схема показва предполагаемия път на агрегиране на амилоид за αS и Tau441 чрез LLPS и LSPT.С допълнителни богати на аниони (червени) и богати на катиони (сини) региони, αS и тау електростатичните коацервати със задоволителна валентност имат по-ниска повърхностна енергия и следователно по-малко коалесценция, което води до бързо стареене на капките.Постига се стабилно неагломерирано състояние на гел..Тази ситуация е много благоприятна в случая на αS/pLK системата поради нейния по-висок афинитет и по-простата мрежа за взаимодействие на протеинова двойка, което позволява бърз гелообразен преход.Напротив, капчици с незадоволителна валентност и следователно заредени с протеини области, достъпни за взаимодействие, улесняват коацервата да се слее и намокри хидрофилната повърхност, за да се намали неговата висока повърхностна енергия.Тази ситуация е за предпочитане за αS/Tau441 коацервати, които имат многовалентна комплексна мрежа, състояща се от слаби Tau-Tau и αS-Tau взаимодействия.На свой ред, по-големите коацервати по-лесно ще запазят своите течноподобни свойства, което позволява да се появят други взаимодействия протеин-протеин.В крайна сметка амилоидните хетерогенни агрегати, съдържащи както αS, така и тау, се образуват в коацерватната течност, което може да е свързано с тези, открити в телата на включване, които са отличителни белези на невродегенеративни заболявания.
Големите течноподобни структури, образувани по време на узряването на αS/Tau441 със силно претоварена, но динамична протеинова среда и, в по-малка степен, αS/ΔNt-Tau коацервати са идеални резервоари за нуклеация на протеинова агрегация.Ние наистина наблюдавахме образуването на твърди протеинови агрегати в този тип протеинови коацервати, често съдържащи както αS, така и тау.Ние показахме, че тези хетероагрегати са стабилизирани чрез неелектростатични взаимодействия, способни са да свързват амилоид-специфични ThT багрила по същия начин като типичните амилоидни фибрили и наистина имат подобна устойчивост на различни влияния.Показано е, че αS/tau агрегатите, образувани от LLPS, имат подобни на амилоид свойства.Наистина, зрелият вариант на Тау с дефицит на амилоидна агрегация е значително нарушен при образуването на тези хетерогенни αS агрегати в течния електростатичен коацерват.Образуването на αS/Tau441 агрегати се наблюдава само вътре в коацерватите, които запазват свойства, подобни на течност, и никога, ако коацерватите/капчиците не достигнат състоянието на гел.В последния случай повишената сила на електростатичните взаимодействия и, като резултат, твърдостта на протеиновата мрежа предотвратяват необходимите конформационни пренареждания на протеини за установяване на нови протеинови взаимодействия, необходими за нуклеация на амилоид.Това обаче може да се постигне в по-гъвкави, подобни на течности коацервати, които от своя страна е по-вероятно да останат течни, докато увеличават размера си.
Фактът, че образуването на агрегати в рамките на кондензираната фаза е за предпочитане в големи αS/Tau кондензати, отколкото в малки капчици, които бързо желират, подчертава значението на идентифицирането на факторите, които контролират коалесценцията на капките.По този начин не само има тенденция за разделяне на фазите, но размерът на кондензата трябва да се контролира за правилно функциониране, както и за предотвратяване на заболявания 58,61.Нашите резултати също подчертават важността на баланса между LLPS и LSPT за системата αS/Tau.Докато образуването на капчици може да предпази от амилоидна агрегация чрез намаляване на количеството протеинови мономери, налични при условия на насищане, както беше предложено в други системи 63, 64, сливането на капчици при високи нива на капчици може да доведе до вътрешна протеинова агрегация чрез бавни конформационни пренареждания.протеинови мрежи..
Като цяло, нашите данни силно подчертават значението на кохезионната валентност и удовлетворените/неудовлетворените взаимодействия в мрежите за падане в контекста на LSPT.По-специално, ние показваме, че кондензатите на αS/Tau441 с пълна дължина са способни ефективно да се сливат и нуклеират, за да образуват подобни на амилоид хетероагрегати, които включват както протеини, така и предлагат молекулярен механизъм, базиран на нашите експериментални резултати.Ко-агрегирането на два протеина в коацервата на αS/Tau течността, което докладваме тук, може наистина да е свързано с ко-локализацията на два протеина във включванията, които са отличителни белези на заболяването, и може да допринесе за разбирането на връзката между LLPS и амилоидна агрегация, проправяйки пътя за силно зареден IDP при невродегенерация.
Мономерни WT-αS, цистеинови мутанти (Q24C-αS, N122C-αS) и ΔCt-αS варианти (Δ101-140) се експресират в Е. coli и се пречистват, както е описано по-горе.5 mM DTT беше включен във всички етапи на пречистването на αS цистеинови мутанти, за да се предотврати образуването на дисулфидна връзка.Tau441 изоформа (плазмид, получен от Addgene #16316), ΔNt-Tau вариант (Δ1–150, получен чрез клониране на IVA с праймери CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) и AggDef-Tau вариант (Δ275–311, пречистен с GGCTC 5 праймер) Е. coli култури бяха нараства до OD600 = 0.6–0.7 при 37°C и 180 rpm и експресията се индуцира с IPTG в продължение на 3 часа при 37°C.Събират се клетки при 11 500 xg за 15 минути при 4 °C и се промиват с физиологичен буфер, съдържащ 150 mM NaCl.Ресуспендирайте пелетата в лизисен буфер (20 ml на 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, бензамидин 50 µM, копептин 100 µM).Етапът на обработка с ултразвук се извършва върху лед с амплитуда от 80% за 10 импулса (1 минута включен, 1 минута изключен).Не превишавайте 60 ml при един ултразвук.Е. coli лизатите се нагряват при 95°С за 20 минути, след това се охлаждат върху лед и се центрофугират при 127,000 х g за 40 минути.Избистрената супернатанта се нанася върху 3,5 kDa мембрана (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) и се диализира срещу 4 L диализен буфер (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 тМ) за 10 часа.5 ml катионобменна колона (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) се еквилибрира с еквилибриращ буфер (20 mM MES, рН 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Тау лизатът се филтрира през 0.22 μm PVDF филтър и се инжектира в колоната при скорост на потока от 1 ml/min.Елуирането се извършва постепенно, тау се елуира с 15-30% буфер за елуиране (20 mM MES, рН 6.8, 1 М NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Фракциите се анализират чрез SDS-PAGE и всички фракции, съдържащи една лента с очакваното молекулно тегло на тау, се концентрират с помощта на 10 kDa центрофужен филтър и се заменят с буфер, съдържащ 10 mM HEPES, рН 7,4, NaCl 500 mM и DTT 2 mM за крайната протеинова концентрация беше 100 μM.След това протеиновият разтвор се прекарва през 0.22 μm PVDF филтър, бързо се замразява и съхранява при -80°C.Протеин K18 беше любезно предоставен от проф. Алберто Бофи.Чистотата на препарата е >95%, както се потвърждава от SDS-PAGE и MALDI-TOF/TOF.Различни цистеини бяха химически белязани с AlexaFluor488-малеимид (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, САЩ) или TEMPOL-малеимид (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада).бяха потвърдени чрез абсорбция и MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau и K18 бяха белязани с нативни цистеинови остатъци в позиции 191 и 322, използвайки Atto647N-малеимид (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Германия), следвайки същата процедура.Картите на нетната такса за остатък за αS и Tau441 бяха генерирани с помощта на CIDER66.
Твърд поли-L-лизин (pLK DP 90-110 според NMR от доставчика, Alamanda Polymers Inc, Хънтсвил, Алабама, САЩ) се разтваря в 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 до 10 mM концентрация, процесът се обработва с ултразвук за 5 минути на ултразвукова водна баня и съхранявайте при -20°C.PEG-8, декстран-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) и FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) са водоразтворими и широко разпространени в LLPS буфер.Диализата премахва замърсяващите соли.След това те се филтрират през филтър за спринцовка с размер на порите 0, 22 μm и техните концентрации се изчисляват с помощта на рефрактометър (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS пробите се приготвят при стайна температура в следния ред: буферът и екструзията се смесват и 1 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-диилдинитрил) тетраоцетна киселина (EDTA, карбоксинт) и смес от 1% протеазен инхибитор (PMSF 100 mM, бензимид 1 mM, леупептин 5 μM).След това се добавят αS и кондензирани поликатиони (опции pLK или Tau).За експерименти с времеви серии на тиофлавин-Т (ThT, Carbosynth, Compton, UK), използвайте общата концентрация на ThT, която да бъде половината от концентрацията на αS.Внимателно, но старателно разбъркайте пробите, за да сте сигурни, че са хомогенни.Концентрацията на всеки компонент варира от експеримент до експеримент, както е описано в раздела Резултати.Азидът се използва в концентрация от 0,02% (w/v), когато продължителността на експеримента надвишава 4 часа.За всички анализи, използващи LLPS проби, оставете сместа да се уравновеси за 5 минути преди анализа.За анализ на разсейване на светлината, 150 µl проби бяха заредени върху несвързващи 96-ямкови микроплаки (µClear®, черен, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Австрия) и покрити с адхезивен филм.LLP се наблюдават чрез измерване на абсорбцията при 350 nm в центъра на разтвора в четец на плаки CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Германия).Експериментите бяха проведени в три екземпляра при 25°C и грешките бяха изчислени като стандартно отклонение от средната стойност.Разредената фаза се определя количествено чрез центрофугиране на пробата и SDS-PAGE гел анализ, а αS фракцията в разредената и концентрираната фази се определя количествено в различни LLPS разтвори.100 μl LLPS проба, съдържаща 1 μM AF488-белязан αS, се приготвя чрез цялостно смесване, последвано от центрофугиране при 9600 × g за 30 минути, след което утайката обикновено се вижда.Горните 50 μl от супернатантата се използват за количествено определяне на протеини с помощта на SDS-PAGE гел.Геловете се сканират с филтри AF488, като се използва система за изображения на гел ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, САЩ) или се оцветяват с оцветяване Coomassie и се визуализират с подходящи филтри.Получените ленти бяха анализирани с помощта на ImageJ версия 1.53i (Национални здравни институти, САЩ).Експериментите бяха проведени в два екземпляра в два различни експеримента с подобни резултати.
Обикновено 150 μl проби се прилагат към несвързващи 96-ямкови микроплаки и се визуализират при стайна температура на обърнат микроскоп Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).За точкови експерименти също бяха използвани µ-Slide ангиогенезни плаки (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) или 96-ямкови полистиренови микроплаки (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 халогенни или живачни металхалогенни лампи бяха използвани като източници на осветление (съответно за BF/DIC и WF изображения).За WF микроскопия беше използван въздушен обектив с 40x увеличение (Leica Microsystems, Германия) за фокусиране на светлината върху пробата и нейното събиране.За маркирани с AF488 и ThT проби, филтър за възбуждане и излъчване със стандартни GFP филтри, лентови филтри за възбуждане и излъчване, съответно, 460–500 nm и 512–542 nm лентови филтри и 495 nm дихроично огледало.За проби, маркирани с Atto647N, бяха използвани стандартен набор от филтри Cy5 с лентови филтри за възбуждане и излъчване 628–40 nm и 692–40 nm, съответно, и 660 nm дихроично огледало.За BF и DIC микроскопия използвайте същия обектив за събиране на отразена светлина.Събраната светлина беше записана на Leica DFC7000 CCD камера (Leica Microsystems, Германия).Времето на експозиция беше 50 ms за BF и DIC микроскопско изображение и 20-100 ms за WF микроскопско изображение.За сравнение, времето на експозиция за всички експерименти с ThT беше 100 ms.Проведени са експерименти с изтичане на времето, за да се визуализира коалесценцията на капчици, като изображенията се събират на всеки 100 ms за няколко минути.ImageJ (NIH, САЩ) беше използван за анализ на изображения.Експериментите бяха проведени в три екземпляра с подобни резултати.
За експерименти с колокализация, FRAP и 3D реконструкция, изображенията бяха получени на Zeiss LSM 880 обърнат конфокален микроскоп, използвайки ZEN 2 синьо издание (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия).Проби от 50 µl бяха приложени към µ-Slide Angiogenesis Петри (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германия), обработени с хидрофилен полимер (ibiTreat) и монтирани в 63× маслен имерсионен обектив (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) на DIC).Изображенията са получени с помощта на 458 nm, 488 nm и 633 nm аргонови лазерни линии с разделителна способност 0,26 µm/пиксел и време на експозиция 8 µs/пиксел за прозорци за откриване на възбуждане и излъчване от 470–600 nm, 493–628 nm, и 638–755 nm се използва за визуализиране съответно на ThT, AF488 и Atto647N.За експериментите с FRAP, фотография с изтичане на времето на всяка проба се записва при 1 кадър в секунда.Експериментите бяха проведени в три екземпляра при стайна температура с подобни резултати.Всички изображения бяха анализирани с помощта на софтуер Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия).Кривите на FRAP бяха нормализирани, начертани и монтирани към данни за интензитет/време, извлечени от изображения с помощта на Zen 2, използвайки OriginPro 9.1.Кривите на възстановяване бяха монтирани към моноекспоненциален модел, за да се отчете молекулярната дифузия с допълнителен експоненциален член, за да се отчете ефектът на избелване на придобиването.След това изчислихме D, използвайки номиналния радиус на избелване и предварително определения полуживот на възстановяване, както в уравнението на Kang et al.5 35 показани.
Единични цистеинови варианти на αS бяха синтезирани с 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) в позиции 24 (TEMPOL-24-αS) и 122 (TEMPOL-122-αS), съответно.Спиново маркиране За EPR експерименти, концентрацията на αS беше зададена на 100 μM и концентрацията на PEG беше 15% (w/v).За различни условия на агрегиране, съотношението αS: pLK е 1:10, докато съотношенията αS: ΔNt-Tau и αS: Tau441 се поддържат при 1:1.За експерименти за титруване на свързване при липса на струпване, TEMPOL-122-αS се поддържа при 50 μM и поликатионите се титруват при нарастващи концентрации, като всяко условие се подготвя отделно.CW-EPR измерванията бяха извършени с помощта на Bruker ELEXSYS E580 X-band спектрометър, оборудван с резонатор Bruker ER4118 SPT-N1, работещ на микровълнова (SHF) честота от ~ 9,7 GHz.Температурата се настройва на 25°С и се контролира от криостат с течен азот.Спектрите са получени при ненаситени условия при MW мощност от 4 mW, амплитуда на модулация от 0.1 mT и честота на модулация от 100 kHz.Спектралните интензитети бяха нормализирани, за да се избегнат разлики в центрофугиращите концентрации между пробите и възможна редукция на центрофугиране поради остатъчни концентрации на редуциращи агенти в проби, съдържащи Tau441 или ΔNt-Tau (присъстващи в оригиналните протеинови разтвори).Дадените стойности на g са получени в резултат на EPR спектрално моделиране, извършено с помощта на софтуера Easyspin (v. 6.0.0-dev.34), внедрен в Matlab®67.За моделиране на данните бяха използвани едно/двукомпонентни изотропни модели.След нормализиране на всички сигнали, остатъците бяха изчислени чрез изваждане на всяка симулация от съответния експериментален спектър.За анализ на титруване на свързване, относителният интензитет на третата лента към втората лента на нормализирания EPR спектър (III/III) се използва за наблюдение на свързването на поликатиони към αS.За да се оцени константата на дисоциация (Kd), получената крива се напасва към приблизителен модел, като се приемат n идентични и независими места на свързване.
Експериментите с NMR спектроскопия бяха проведени с помощта на Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR спектрометър, оборудван с криосонда и Z-градиент.Всички експерименти бяха проведени с използване на 130–207 µM αS и съответните αS/ΔNt-Tau и pLK еквиваленти в 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7, 4 и бяха извършени при 15 ° C.За да се наблюдава LPS чрез NMR, 10% PEG се добавя към предварително смесените проби.Графиката на смущението на химическото изместване (фиг. 1b) показва средните 1H и 15N химични измествания.Спектрите αS 2D1H-15N HSQC бяха присвоени въз основа на предишно присвояване (BMRB запис #25227) и потвърдени чрез записване и анализиране на 3D спектрите на HNCA, HNCO и CBCAcoNH.Химичните отмествания на 13Cα и 13Cβ бяха изчислени в присъствието на ΔNt-Tau или pLK за измерване на възможните промени в тенденциите на вторичната структура в сравнение с химическите отмествания на αS в чиста произволна конформация на намотка 68 (допълнителна фигура 5c).Скоростите на R1ρ бяха измерени чрез записване на експерименти hsqctretf3gpsi (получени от библиотеката на Bruker) със закъснения от 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 и 800 ms, а експоненциалните функции бяха коригирани към закъсненията на пиковия интензитет при различни пъти за определяне на R1ρ и неговата експериментална несигурност.
Експериментите с двуцветна флуоресцентна микроскопия с разделителна способност във времето бяха проведени на търговски флуоресцентен конфокален микроскоп с разделителна способност MT200 (PicoQuant, Берлин, Германия) с устройство за броене на единични фотони (TCSPC), свързано с времето.Главата на лазерния диод се използва за импулсно преплетено възбуждане (PIE), лъчът преминава през едномодов вълновод и се настройва на лазерна мощност от 10 до 100 nW за 481 nm и 637 nm лазерни линии, измерени след дихроично огледало.Това гарантира оптимална скорост на броене на фотони, като се избягват ефектите от нагласяне на фотоните, фотоизбелване и насищане.Покривни стъкла или плочи за μ-Slide ангиогенеза (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) бяха поставени директно във вода за потапяне върху леща Super Apochromat 60x NA 1.2 с коригираща яка (Olympus Life Sciences, Waltham, САЩ).488/640 nm дихроично огледало (Semrock, Lake Forest, IL, САЩ) беше използвано като разделител на главния лъч.Нефокусираното лъчение се блокира от дупка с диаметър 50 микрона, след което фокусираното лъчение се разделя на 2 пътя за откриване чрез разделител на лъча 50/50.Пред детектора бяха използвани лентови емисионни филтри (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 за зелено багрило (AF488) и 690/70 за червено багрило (Atto647N).Като детектори бяха използвани еднофотонни лавинни диоди (SPAD) (Micro Photon Devices, Болцано, Италия).Събирането и анализът на данни бяха извършени с помощта на достъпния в търговската мрежа софтуер SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия).
Петдесет микролитра от LLPS проби бяха приложени към μ-Slide ангиогенезни ямки (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия).Получените изображения са фокусирани до 20 µm над дъното на кладенеца за оптимално обективно работно разстояние за суспендирани капчици и до ~1 µm за салове и точки с аксиална разделителна способност от поне 0,25 µm/пиксел и време на забавяне от 400 µs/пиксел.Изберете данни, като приложите праг на интензитета въз основа на средния интензитет на фоновия сигнал (PBG, средно + 2σ) за всеки канал, така че да бъдат избрани само течни протеинови капчици, салове или петна, филтрирайки всеки възможен произход от дисперсната фаза.За да анализираме продължителността на живота на всеки вид (τ) на всеки канал (зелено, „g“ за AF488 и червено, „r“ за Atto647N), ние избрахме региони на интерес (ROI), съдържащи капчици, салове или петна (допълнителна фигура 1 ).8b) и ги извлече чрез монтиране на тяхното разпадане през целия живот (τD, τR и τP съответно за капчици, салове или петна, вижте допълнителна фигура 8c) във всеки канал, използвайки анализ на опашката и двукомпонентен модел на разпадане.Средно τ от τ .ROI, които произвеждат твърде малко фотони за мулти-експоненциално напасване, бяха изключени от анализа.Използваната граница беше <104 фотона за салове и точки и 103 за капки.Капките имат по-нисък праг, тъй като е трудно да се получат криви на разпадане с по-високи стойности на интензитета, тъй като капките в полето на изображението обикновено са по-малки и по-малко на брой.ROI с брой фотони над лимита за натрупване на фотони (настроен на >500 броя/пиксел) също бяха изхвърлени за анализ.Съпоставете кривата на затихване на интензитета, получена от интересуващия ви регион, с интензитет при 90% от максимума (малко след максималния интензитет на затихването) от началото на експлоатационния живот, за да осигурите минимална IRF интерференция, като същевременно поддържате същото за цялото затихване на интензитета настройки Относителен времеви прозорец Бяха анализирани 25 до 50 ROI за салове и петна и 15-25 ROI за капки, изображения, избрани от повече от 4 повторения, записани от поне 3 независими експеримента.Използвани са двустранни t-тестове за оценка на статистическите разлики между видовете или между коацерватните системи.За анализ на пиксел по пиксел на живота (τ), беше изчислено общото затихване на живота през полето за всеки канал и беше извършено приближение на 2/3-компонентен модел на експоненциално затихване.След това затихването през целия живот за всеки пиксел беше монтирано с помощта на предварително изчислени τ стойности, което доведе до псевдоцветно FLIM подходящо изображение.Обхватът на продължителността на живота на опашката беше еднакъв за всички изображения на един и същ канал и всяко разпадане произвеждаше достатъчно фотони, за да осигури надеждно напасване.За FRET анализ, пикселите бяха избрани чрез прилагане на по-нисък праг на интензитет от 100 фотона, което осреднява фонов сигнал (FBG) от 11 фотона.Интензитетът на флуоресценция на всеки канал беше коригиран чрез експериментално определени корекционни фактори: 69 спектрално пресичане α беше 0.004, директно възбуждане β беше 0.0305, ефективността на откриване γ беше 0.517.След това ефективността на FRET на ниво пиксел се изчислява с помощта на следното уравнение:
където FDD е интензитетът на флуоресценция, наблюдаван в донорния (зелен) канал, FDA е интензитетът на флуоресценция, наблюдаван в акцепторния (червен) канал при индиректно възбуждане, и FAA е интензитетът на флуоресценция, наблюдаван в акцепторния (червен) канал при директно възбуждане ( БАНИЦА).В канала се наблюдават импулси на интензитет на флуоресценция).
Поставете 100 µl от LLPS реакционни разтвори, съдържащи 25 µM небелязан мономерен Tau441 (със или без 25 µM αS) в LLPS буфер (допълнен както по-горе) върху несвързващи 96-ямкови микроплаки с покритие от адхезивно фолио и образуването на капчици се проверява чрез WF микроскопия след равновесие.в рамките на 10 мин.След 48 часа инкубация при стайна температура се потвърждава наличието на протеинови салове и петна.След това внимателно отстранете течността над плотовете от ямките, след това добавете 50 L дисоциационен буфер (10 mM HEPES, рН 7,4, 1 М NaCl, 1 mM DTT) и инкубирайте за 10 минути.Високата концентрация на сол гарантира, че LLPS няма да се повтори поради остатъчния PEG и възможните протеинови групи, образувани само от електростатични взаимодействия, ще бъдат разглобени.След това дъното на ямката се изстъргва внимателно с върха на микропипета и полученият разтвор се прехвърля в празна ямка за наблюдение.След инкубиране на пробите с 50 μM ThT в продължение на 1 час, наличието на изолирани петна се проверява чрез WF микроскопия.Пригответе обработени с ултразвук αS фибрили чрез инкубиране на 300 µl от 70-µM разтвор на αS в PBS с pH 7,4, натриев азид 0,01% при 37 °C и 200 rpm върху орбитален шейкър за 7 дни.След това разтворът се центрофугира при 9600 × g за 30 минути, утайката се ресуспендира в PBS рН 7,4 и се обработва с ултразвук (1 минута, 50% цикъл, 80% амплитуда във Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) фибрилни проби с относително равномерно разпределение на размера на малки фибрили.
FCS/FCCS анализ и откриване на двуцветно съвпадение (TCCD) бяха извършени на същия MT200 флуоресцентен конфокален микроскоп с времева разделителна способност (Pico-Quant, Берлин, Германия), използван за експериментите с микроскопия FLIM-FRET, използвайки режим PIE.Мощността на лазера за тези експерименти беше добавена до 6,0 µW (481 nm) и 6,2 µW (637 nm).Комбинацията от тези мощности на лазера беше избрана, за да произведе подобна яркост за двойките използвани флуорофори, като същевременно се постигат оптимални скорости на броене и се избягва фотоизбелването и насищането.Събирането и анализът на данни бяха извършени с помощта на наличния в търговската мрежа софтуер SymphoTime64 версия 2.3 (PicoQuant, Берлин, Германия).
Проби от изолирани αS/Tau агрегати, получени с помощта на LLPS, се разреждат в буфер за изолиране до подходящата мономолекулна концентрация (обикновено разреждане 1:500, тъй като агрегатите вече са в ниски концентрации, когато са изолирани от коацерватни проби).Пробите се нанасят директно върху покривни стъкла (Corning, САЩ), предварително покрити с разтвор на BSA в концентрация от 1 mg/mL.
За PIE-smFRET анализа в зелените и червените канали беше приложен по-нисък праг на интензитет от 25 фотона, за да се филтрират сигнали с нисък интензитет, причинени от мономерни събития (имайте предвид, че мономерите превъзхождат агрегираните проби в сравнение с изолираните агрегати).Този праг беше изчислен като пет пъти средния интензитет на мономерния αS, получен от анализа на чисти мономерни проби, за да се изберат конкретно агрегати за анализ.Веригата на задвижване PIE, заедно със събирането на данни TSCPC, даде възможност за прилагане на доживотен филтър за претегляне, който помага за елиминирането на фоновото и спектралното пресичане.Интензитетът на пламъка, избран с помощта на горните прагове, беше коригиран с помощта на средния фонов сигнал, определен от хистограмите на поява спрямо интензитет/бин на пробите само с буфер.Избухванията, свързани с големи агрегати, обикновено заемат няколко последователни интервала във времевата следа (настроена на 1 ms).В тези случаи беше избран контейнер с максимална якост.За FRET и стехиометричен анализ беше използван теоретично определения гама фактор γ (0,517).Приносите на спектралното пресичане и директното възбуждане са незначителни (определени експериментално) при използваната възбуждаща лазерна мощност.Ефективността и стехиометрията на FRET при експлозия се изчисляват, както следва.