347 спираловидна тръба от неръждаема стомана химичен компонент, Идентифициране на нови чувствителни към интерферон човешки левкоцитен антиген-А (HLA-A) шаперонови протеини с помощта на омрежена масова спектрометрия (CLMS)

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Плъзгачи, показващи три статии на слайд.Използвайте бутоните за връщане назад и напред, за да се движите през слайдовете, или бутоните за управление на плъзгачите в края, за да се движите през всеки слайд.

Описание на продукта

Серпентини от неръждаема стомана 347L, степен на стомана: SS347L

Интерфероновата сигнална система индуцира силен цитокинов отговор към широк спектър от патогенни и присъщи патологични сигнали от околната среда, което води до индукция на подгрупи от интерферон-индуцируеми протеини.Приложихме DSS-медиирана кръстосана масова спектрометрия (CLMS), за да открием нови протеин-протеинови взаимодействия в областта на индуцираните от интерферон протеини.В допълнение към очакваните интерферон-индуцируеми протеини, ние също така идентифицирахме нови междумолекулни и вътрешномолекулни кръстосано свързани адукти на канонични интерферон-индуцируеми протеини като MX1, USP18, OAS3 и STAT1.Фокусирахме се върху ортогонално валидиране на нов набор от интерферон-индуцируеми протеинови мрежи, образувани от HLA-A протеини (H2BFS-HLA-A-HMGA1), използвайки ко-имунопреципитация и тяхното по-нататъшно изследване с помощта на моделиране на молекулярната динамика.Моделирането на конформационната динамика на протеиновия комплекс разкрива няколко места на взаимодействие, които отразяват взаимодействията, идентифицирани в откритията на CLMS.Заедно представяме пилотно проучване на CLMS за идентифициране на нови сигнални комплекси, индуцирани от интерферон, и очакваме по-широкото използване на CLMS за идентифициране на нова динамика на протеинови взаимодействия в туморната микросреда.
Преди да започне адаптивен имунен отговор, вродената защитна система на гостоприемника създава антимикробен отговор, медииран от семейство секретирани алфа-спирални цитокини, наречени интерферони (IFN).Тип I IFN класове IFNα и IFNβ активират клетъчни отговори, включително антивирусни, проапоптотични, провъзпалителни и антипролиферативни състояния.При хората са известни 13 подтипа на IFNα, всички групирани на хромозома 91. Изненадващо, само IFNα2 е изследван за клинична употреба.Напоследък се обръща специално внимание на изследванията върху други подвидове IFNα.Скорошно проучване показа, че IFNα14 е една от най-ефективните изоформи за ограничаване на репликацията на HBV2 и HIV-13,4 в сравнение с каноничния подтип IFNα2.
Установено е, че активираните тип I интерферонови рецепторни комплекси (IFNAR1 и IFNAR2) задействат каскада на сигнална трансдукция, медиирана от Janus кинази TYK2 и JAK15,6.Тези Janus кинази фосфорилират сигнални преобразуватели и транскрипционни протеинови активатори (STAT1 и STAT2) върху тирозинови остатъци, за да инициират SH2 домейн-медиирана хетеродимеризация6.Впоследствие IRF9 свързва STAT хетеродимери, за да образува тримерен комплекс на IFN-стимулиран фактор 3 ген (ISGF3), който се премества в ядрото и индуцира транскрипцията на над 2000 интерферон-стимулирани гени (ISG) 5,6,7,8.
ISG формират гръбнака на вродената имунна система, особено в отговор на вирусна атака.Като първа линия на защита срещу вирусна инфекция, клетките бързо разгръщат обширни взаимодействия на клетъчни протеини с широк спектър от биологични дейности.Тези протеини включват рецептори за разпознаване на образи, сигнални молекули, транскрипционни фактори и протеини с директни антивирусни функции, както и отрицателни регулатори на имунните отговори9.Голяма част от информацията за активността на ISG идва от функционални екрани, използващи екрани за свръхекспресия 10, 11 или техники за заглушаване на гени (siRNA, RNAi и CRISPR) 12, 13, при които отделните ISG се експресират или инхибират и тяхната активност се тества върху различни вируси.Въпреки че тези проучвания са определили антивирусните свойства на отделните ISGs, основните молекулярни механизми на всеки ISG остават до голяма степен неизвестни.Общоприето е, че много протеини взаимодействат с един или повече цитокини, за да осигурят пълна активност, така че или ISG взаимодействат директно, или техните взаимодействия се медиират от клетъчни протеини.Например, скорошно изследване на фотоомрежена протеомика идентифицира ATPase VCP/p97 като основен партньор за взаимодействие на IFITM3, чието инхибиране води до дефекти в лизозомното сортиране, оборот и котранспорт на IFITM3 с вирусни частици 14 .Използвайки имунопреципитация, ние идентифицирахме VAPA, протеин, свързан с везикули, като партньор за взаимодействие с IFITM1/2/3, който медиира холестерол-медиираното вирусно съзряване, и това беше потвърдено от друго проучване, използващо двухибридна система от дрожди.Научна подкрепа 15 , 16 .
Основен биологичен процес, участващ в потискането на инфекцията и злокачествената трансформация, е представянето на антиген, което се медиира от главните молекули на хистосъвместимия комплекс (МНС).Пептиди (с дължина 8-12 аминокиселини) от разцепени, преждевременно прекратени или неправилно нагънати протеини се зареждат в MHC-I хетеродимера (състоящ се от MHC-I тежки и леки вериги, наречен β-2-микроглобулин; β2M) 17,18.Получените стабилни MHC-I тримери се транспортират до клетъчната повърхност, където представят вътреклетъчни пептиди на CD8+ Т клетки (цитотоксични Т клетки)17.Т-клетките разпознават и унищожават тези патогени и клетки, носещи тумор-специфичен антиген.Следователно, патогените и туморните клетки често потискат процеса на представяне на антигена, за да избегнат имунното наблюдение.В допълнение, MHC-I се регулира надолу при 40-90% от човешките тумори и често се свързва с по-лоша прогноза19.
Гените, участващи в реагирането на патогени, трябва бързо да превключват между състояние на покой и състояние на активна транскрипция.Следователно се предполага, че няколко клетъчни протеини участват в отговора на високото търсене на IFN за кратки периоди от време, включително ремоделиране и модификация на промоторния хроматин 20,21.Повечето проучвания са фокусирани върху идентифицирането на отделни партньори на ISG протеин в присъствието на IFN.Няколко протеомични и транскриптомни изследвания в моделни клетъчни системи изясниха ефекта на IFN върху клетъчния пейзаж.Въпреки нарастващото разбиране на динамиката, предизвикана от интерфероните, ние все още знаем малко за участието на ISG.Когато се разглежда сложността и зависимата от времето динамика на интерфероновото сигнализиране, възникват два въпроса: (i) възможно ли е да се стабилизират и уловят мултипротеиновите комплекси, участващи в бързото сигнализиране, и (ii) могат ли тези взаимодействия да бъдат картографирани в 3D пространство?
За да се справим с тези проблеми, ние внедрихме медиирано от дисукцинимид суберат химическо кръстосано свързване (DSS), съчетано с масова спектрометрия (CLMS), за да изследваме индуцираната от IFNα мрежа за протеиново взаимодействие и нейната динамика.DSS добавя ковалентни връзки между проксималните остатъци на протеини и/или протеинови комплекси in vivo.Последващият MS анализ разкрива специфични места на омрежване, които отразяват пространствената близост на региони в определен протеин, наречени вътрешни връзки, или субединици в протеинови комплекси, наречени взаимовръзки.Използвайки този подход, ние идентифицирахме няколко нови протеин-протеинови комплекси, както и индуцирани от интерферон мултипротеинови мрежи за взаимодействие.Чрез по-нататъшно тестване на подмножество от тези нови взаимодействия, ние демонстрираме, че H2BFS (H2B хистонов тип FS; наричан по-нататък H2B) и MDN1 действат като свързващи партньори за HLA-A.
Клетките Flo-1 са едни от най-известните in vitro модели на аденокарцином на хранопровода, тъй като те имитират ключови характеристики на тумори на хранопровода 22, 23.Въпреки това, не всички тумори са имуногенни и за да определим дали Flo-1 клетките реагират на лечение с интерферон, ние третирахме Flo-1 клетки с 10 ng/ml IFNα в продължение на 72 часа.Клетките Flo-1 показват ранна индукция на pSTAT1 и IRF1, започваща 2 часа след третирането и продължаваща 72 часа, със зависимо от времето намаляване на стационарните нива на IRF1 (Фигура 1А).Установено е, че ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 и ISG15) са силно индуцирани след 6 часа, имитирайки класическия отговор на средната и късната фаза на IFNα (Фигура 1А).Заедно тези данни предполагат, че този клетъчен модел може да се използва за изследване на отговорите на интерферона.
Диференциални отговори на протеинова експресия в Flo-1 клетки след лечение с IFNα.(А) Експресията на протеин във Flo-1 клетки, третирани с 10 ng/ml IFNα за 2, 6, 24, 48 и 72 часа, се анализира чрез имуноблот, като се използват посочените ISG антитела.(B) Оцветени с кумаси синьо SDS-PAGE гелове на цели клетъчни екстракти след омрежване с DSS за посочените времена и концентрации.(C) Представителен имуноблот, изследван с p53(DO-1) антитяло от същите проби, за да се оцени степента на протеиново омрежване.
За да уловим пейзажа на in situ протеиново взаимодействие, ние използвахме DSS, широко използван омрежващ агент поради високата си пропускливост на мембраната и сравнително кратко време за реакция.По-краткото време за реакция помага да се предотврати образуването на големи агрегати от омрежени протеини, като по този начин се поддържа стабилността на омрежващия агент.За да определим оптималната концентрация на DSS и да избегнем прекомерното омрежване, първо изложихме клетките на 5, 2,5 и 1 mM DSS за съответно 5, 10, 5 и 30 минути и анализирахме лизатите чрез оцветена с Coomassie SDS-PAGE (данните не са показани).Клетъчните лизати изглеждат силно омрежени при най-ниската концентрация и в най-краткия момент от време.Следователно, DSS се титрува до 1, 0,5 и 0,1 mM за 5 минути (Фигура 1В).В допълнение, Фигура 1C показва Western blot, извършен с помощта на р53 (DO-1) антитялото за оценка на степента на протеиново омрежване.
Flo-1 клетки бяха третирани с 10 ng/ml IFNα за 24 часа преди добавяне на омрежващия агент.Омрежените клетки впоследствие се лизират чрез двуетапна протеолиза и протеините се обработват от FASP (фиг. 2) 24, 25.Омрежените триптични пептиди се анализират чрез масспектрометрия (фиг. 2).Омрежените пептиди бяха идентифицирани от получените спектри с помощта на програмата SIM-XL и отделните съединения бяха комбинирани в сложна мрежа с помощта на тръбопроводите за изчислителен софтуер с отворен код xQuest28 и SIM-XL29 (фиг. 2).SIM-XL идентифицира протеин-протеинови взаимодействия, вътрешни вериги и отделни вериги в прости или сложни протеинови смеси и предоставя скриптове за визуализиране на взаимодействията в протеиновите структури.В допълнение, той класира всяка кръстосана препратка като ID резултат според качеството на спектъра MS/MS29.Идентифицирани са няколко високонадеждни протеин-протеинови взаимодействия и комплекси и нов набор от взаимодействия е допълнително изследван с помощта на ко-имунопреципитация и конформационни промени на комплекси с помощта на моделиране на молекулярната динамика (MD) (Фиг. 2) 30, 31.
Схематичен преглед на метода CLMS.Flo-1 клетки бяха третирани с 10 ng/ml IFNα в продължение на 24 часа, последвано от in situ протеиново омрежване с помощта на DSS, последвано от клетъчен лизис и трипсинизация.Омрежени проби бяха анализирани с помощта на масспектрометър Orbitrap и допълнително взети проби за фрагментиране на пептидни прекурсори по време на LC-MS/MS.Два свързани пептида бяха идентифицирани от получените спектри с помощта на Spectrum Recognition Machine на програмата Crosslinked Peptides (SIM-XL) и всички съединения бяха комбинирани в сложна мрежа с помощта на изчислителни тръбопроводи.Филтриране на взаимодействията с ниска степен на увереност въз основа на резултати от честота на фалшиви положителни резултати (FDR).Няколко нови висококачествени протеин-протеинови взаимодействия бяха допълнително потвърдени с помощта на ко-имунопреципитация и конформационните промени в комплексите бяха изследвани с помощта на моделиране на молекулярната динамика (MD).
Общо ~ 30 500 и ~ 28 500 пептида бяха открити с помощта на MaxQuant в нестимулирани и стимулирани IFNα проби, съответно (допълнителна таблица S1, фиг. 3A).Разпределението на дължината на пептида и в двата случая показва по-голям дял от по-големи пептиди, което показва наличието на омрежени пептиди (Фиг. 3B, C).В допълнение, по-голяма част от по-големи пептиди присъстваха в диапазона 40-55 в проби, третирани с IFNα (фиг. 3C).Протеиновото картографиране спрямо интензитета на log2 показа, че класическите интерферон-стимулирани протеини са най-изобилни в сравнение с нетретирани проби, включително MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 и HLA-F (Фигура 3D).Анализът на пътищата за протеини, обогатени повече от три пъти в отговор на лечение с IFNα, използвайки базата данни за пътя на Reactome, показа, че MHC-I-медиираното представяне и обработка на антиген е най-доминиращият път (Фигура 3E).В съответствие с по-ранни доклади, антивирусните отговори, медиирани от OAS и ISG15, както и IFNα/β и цитокиновото сигнализиране са сред активираните пътища.В допълнение, лизин- и серин-специфични протеинови кръстосани връзки бяха идентифицирани от първоначално получените MS/MS спектри с помощта на SIM-XL.Скорошно проучване съобщава за 104 ISG, обхващащи 20 вируса от 9 класа вируси чрез мета-анализ на индивидуални проучвания за свръхекспресия на ISG в 5 типа клетки9.Въпреки това, за да преодолеем изчислителните ограничения на скрининга на големи набори от данни, ние започнахме с по-малък набор от данни, за да проучим възможните взаимодействия между списъка с IRDS гени, докладвани от Padaria et al., повечето от които са ISG.
Идентифициране на диференциално експресирани омрежени протеини в отговор на IFNα (данни, получени от MaxQuant).Разпределение на дължината на пептида на нетретирани (B) и третирани с IFNα (C) омрежени проби.(D) Топлинна карта, представляваща log2 (LFQ интензитет) между нетретирани и третирани с IFNα14 Flo-1 клетки.Левият панел показва протеините, които са най-активно активирани в присъствието на IFNα.Базата данни за пътя на Reactome анализира повече от четирикратни промени в регулираните нагоре IFNα-реагиращи протеини.
Интерферон-медиираната ISG стимулация е добре документирана, но на молекулярно ниво е слабо разбрано как тези протеини кулминират в широк спектър от биологични функции.Изследвахме протеинови взаимодействия с висока степен на увереност между известни ISG.Интересното е, че идентифицирахме мрежа, включваща MX1, USP18, ROBO1, OAS3 и STAT1 протеини, които образуват голям комплекс в отговор на лечение с IFNα (Фигура 4, Таблица S2) 32,33,34.Най-важното е, че тези взаимодействия са открити във всички три екземпляра, третирани с IFNα и не са открити в нетретирани проби, което предполага, че те са образувани специфично в отговор на третиране с IFNα.Известно е, че STAT1 транскрипционно регулира експресията на тези ISG, но взаимодействието му с ISG на ниво протеин не е проучено.Кристалната структура на STAT1 показа, че неговият спирален домен (CCD) не участва във взаимодействието с ДНК или протомери по време на образуването на димери35.Тези α-спирали образуват спирална спирална структура, която осигурява предимно хидрофилна повърхностна площ за възникване на взаимодействия 35 .В нашите данни от CLMS наблюдавахме, че повечето от взаимодействията със STAT1 се случват в SH2 домейна, предшестващ CCD, линкерния домейн или С-терминалната опашка (остатъци 700-708) (Фигура 4А).Предишно проучване съобщава, че USP18 се свързва с CCD и ДНК-свързващия домен (DBD) на STAT2 и се набира към субединицата на рецептора на интерферон тип I IFNAR2, за да медиира инхибирането на сигнализирането на интерферон тип I 24.Нашите данни също така показаха, че USP18 каталитичният домейн взаимодейства със STAT1 DBD (Фигура 4A, D), което предполага, че и STAT1, и STAT2 могат да играят роля в привличането на USP18 към IFNAR2.
(A) 2D диаграма на взаимодействие, показваща взаимодействия протеин-протеин (генерирани в програмата SIM-XL), с линии, представляващи междумолекулни взаимодействия (прекъсване на кръстосаните връзки, зададено на 3,5).Домейните с различни идентичности са маркирани с техния цвят32: домейн MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) и GED (569–660).OAS3 домейни: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) и OAS1_C (903-108).Домейн ROBO1, Ig_3 (67–151), I-набор (170–258), I-набор (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) и fn3 (777–864).STAT1 полета: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) и STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Кръгов зрител на омрежени протеини (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 и STAT1) с взаимодействия и взаимодействия, отбелязани съответно в синьо и червено.Прагът на кръстосана връзка беше зададен на 3,5.Точковите диаграми показват сайтове на взаимодействие STAT1 с MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) и OAS3 (F), както и места на взаимодействие K или S между двата пептида.На фигурата прагът на резултата за кръстосана връзка е зададен на 3,0.(G) Различни сайтове на взаимодействие между STAT1 и OAS3 DI домейни, насложени върху техните протеинови структури в PyMol (система за молекулярна графика PyMOL, версия 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) и OAS3 (pdb id: 4s3n34).) програма.
Две изоформи на USP18 са описани при хора, протеин с пълна дължина, който е разположен предимно в ядрото, и изоформа без N-терминален домен, USP18-sf, който е равномерно разпределен в цитоплазмата и ядрото 36 .Освен това се предполага, че N-краят е неструктуриран и не изисква изопептидазна активност или ISG1537 свързване.Повечето от взаимодействията, идентифицирани в нашето изследване, са разположени в N-края на протеина, което предполага, че тези взаимодействия включват USP18 с пълна дължина (Фигура 4A, D) и следователно вероятно се появяват в ядрото.Освен това, нашите данни също показват, че N-краят е специализиран за взаимодействия протеин към протеин.Мястото на свързване на IFNAR2 е разположено между остатъци 312-368 и по-специално нито един от протеините в комплекса не се свързва с този регион (Фиг. 4А) 37,38.Тези данни взети заедно показват, че IFNAR2 свързващият домен се използва изключително от рецепторния протеин.Освен това беше установено, че само OAS3 и ROBO1 са свързани с домейни нагоре по течението на N-края и мястото на свързване на IFNAR2 (Фигура 4А).
ROBO1 принадлежи към суперсемейството на имуноглобулини (Ig) от трансмембранни сигнални молекули и се състои от пет Ig домена и три фибронектинови (Fn) домена в извънклетъчната област.Тези извънклетъчни домени са последвани от мембранно-проксимална област и единична трансмембранна спирала 39. Неструктурирана вътреклетъчна област е разположена в С-края и съдържа запазени мотиви на последователност, които медиират свързването на ефекторен протеин 39.Областта, простираща се от аминокиселини ~1100 до 1600, е предимно неподредена.Ние открихме, че MX1 взаимодейства с ROBO1 чрез Ig, Fn и вътреклетъчни домени, докато повечето взаимодействия със STAT1 възникват между неговия CCD, линкерен домейн и С-края на ROBO1 (Фиг. 4A, E).От друга страна, взаимодействията с DI, DIII и OAS3 линкерни региони са разпределени в ROBO1 протеина (Фиг. 4А).
Семейството протеини на олигоаденилат синтазата (OAS) приема и свързва вътреклетъчната двойноверижна РНК (dsRNA), претърпява конформационни промени и синтезира 2',5'-свързани олигоаденилати (2-5 As) 40 .Беше установено, че сред трите OAS, OAS3 проявява най-висок афинитет към dsRNA и синтезира най-малкото количество от 2-5 As, което може да активира RNase L и по този начин да ограничи вирусната репликация 41 .Семейството OAS се състои от полимераза бета (pol-β)-подобни нуклеотидни трансферазни домени.Предишни изследвания показват, че каталитичната активност на С-терминалния домен (DIII) зависи от dsRNA-свързващия домен (DI), който е необходим за активирането на OAS342.Ние наблюдавахме, че DI и DII домейните на OAS3 взаимодействат с CCD и малка съединителна област между SH2 и STAT1 TAD (Фигура 4A, F).Наслагването на различни места за омрежване върху структурата на протеина разкри взаимодействие между β-лист и DBD STAT1 контур и отворен джоб или кухина, образувана от остатъци 60–75 в DI домейна на OAS3 (фиг. 4G).Ориентацията на протеините в комплекса също така показва, че нито едно от взаимодействията с OAS3 не пречи на ДНК-свързващата способност на неговия DI домейн (фиг. S1A).В допълнение, N-терминалният домейн на GTPase MX1 взаимодейства широко с DI и DIII домейните на OAS3 (фиг. 4А).Ние също така наблюдавахме взаимодействие между OAS1 и MX1 във всичките три повторения, третирани с IFNα, където един домейн OAS1 (също каталитично активен) взаимодейства с всичките три домена MX1 (Фигура S2A, B).
MX протеините са част от голямо семейство динеин-подобни GTPases, които съдържат N-терминален GTPase домен, който свързва и хидролизира GTP, междинен домейн, който медиира самосглобяването, и C-терминален левцинов цип, който действа като GTPase (LZ ).домейн ефекторен домейн25,43.MX1 се свързва със субединици на вирусни полимерази, за да блокира транскрипцията на вирусния ген43.По-рано докладван двухибриден скрининг на дрожди показа, че свързаният с PIAS1 MX1 инхибира STAT1-медиираната генна активация чрез блокиране на ДНК-свързващата активност и също така има SUMO E344,45 лигазна активност.Тук ние демонстрираме, че MX1 се свързва със STAT1 (Фигура 4C, D), но как това взаимодействие засяга STAT1-медиираното генно активиране в отговор на IFNα се нуждае от допълнително проучване.В допълнение, ние също открихме, че MX1 взаимодейства с IFIT3 и DDX60 във всичките три повторения, третирани с IFNα (фиг. S2C).
DDX60 е IFN-индуцирана цитоплазмена хеликаза, за която по-рано се съобщава, че играе роля в RIG-I-независимото разграждане на вирусна РНК46.Той взаимодейства с RIG-I и активира своето сигнализиране по лигандно-специфичен начин 46. DDX60 се състои от DEXD/H-Box хеликазен домен и С-терминален хеликазен домен, които свързват вирусна РНК и ДНК47.Повечето от неговите взаимодействия с MX1 и IFIT3 се случват в дълги N- и C-терминални региони без канонични домейни или мотиви (фиг. S2E, F).Въпреки това, MX1 също е свързан с хеликазния домейн DEXD/H-Box (фиг. S2E).Протеините от семейството на IFIT имат тандемни копия на отличителен мотив спирала-завой-спирала, наречен тетрапептидно повторение (TPR).Установено е, че IFIT3 е положителен модулатор на сигнализирането на RIG-I и следователно е компонент на комплекса MAVS.Взети заедно, нашите данни предполагат, че IFIT3 и DDX60 взаимодействат основно в региона между TPR 3–6 на IFIT3 и могат да играят роля в сигнализирането на RIG-I/MAVS (фиг. S2F).
Като се има предвид, че скринингът на целия протеом е интензивен в изчислителна гледна точка, след това скринирахме цялата човешка UniProt база данни за наличието на един от третираните с IFNα повторения.В тази реплика открихме няколко изключително надеждни мрежи за взаимодействие за HLA-A.Анализът на протеиновите пътища, идентифицирани чрез MS/MS спектрите, показа, че MHC-I-базирана обработка и представяне на антиген е основният път, индуциран от интерферон (фиг. 3D).Следователно, ние се фокусирахме върху изучаването на протеиновите взаимодействия на MHC-I молекулите с висока степен на увереност във всички омрежени проби.HLA се състои от α1, α2 и α3 домени и леки вериги, а микроглобулин β2 (β2m) е постоянен шаперонов протеин49.Веднъж събран в ендоплазмения ретикулум, HLA е нестабилен в отсъствието на пептидни лиганди50.Пептид-свързващият жлеб се формира от силно полиморфните и неструктурирани α1 и α2 домени в непептидна форма и относително по-малко полиморфния α351 домен.В присъствието на IFNα открихме два HLA-A комплекса: единият взаимодейства с HMGA1 и H2B (Фигура 5, Таблица S3), а другият взаимодейства с MDN1, LRCH4 и H2B (Фигура 6).
IFNα индуцира мрежа за взаимодействие на HLA-A с H2B (H2BFS) и HMGA1..Прагът на кръстосана връзка беше зададен на 3,5.Точковите диаграми показват местата на взаимодействие на HLA-A с H2B (B) и HMGA1 (C), както и местата на взаимодействие на K или S между двата пептида.На фигурата прагът на резултата за кръстосана връзка е зададен на 3,0.(D) Връзки между протеини, показани в структурите на протеините H2B, HLA-A и HMGA1 в програмата PyMOL.
IFNα индуцира мрежа за взаимодействие на HLA-A с H2B (H2BFS), MDN1 и LRCH4.(A) Вътрешномолекулярни (червени) и междумолекулни (сини) кръстосани връзки, представени на 2D интерактивна карта (генерирана в софтуера SIM-XL) с MDN1, представен като кръг.Прагът на кръстосана връзка беше зададен на 3,5.Домейните с различни идентичности са цветно кодирани32: H2B (хистон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, група C1; 210–290 и MHC_I_C; 337–364) и LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) и CH (535–641)).(B) Връзки между протеини, показани в структурите на протеините H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1 в програмата PyMOL.Тези структури бяха моделирани с помощта на сървъра Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) с шаблонни структури 1kx552, 1kj349, 6hlu62 и 6i2665 за протеините H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1, съответно.Точкови диаграми, показващи K или S сайтове за взаимодействие за HLA-A с H2B (C), LRCH4 (D) и MDN1 (E).За графиките прагът на резултата за кръстосана връзка беше зададен на 3,0.
В допълнение към поддържането на целостта на генома, хистонът H2B също участва в регулирането на транскрипцията.H2B протеинът се състои от централен хистонов домен (HFD), образуван от три α-спирали, разделени от бримки и С-терминална опашка 41, 52.По-голямата част от взаимодействието с H2B се случва в α1 спиралата, която осигурява тримеризация с HFD хетеродимера (фиг. 5A, B).Въпреки че лизините участват в свързването на ДНК, някои лизини също са алтернативни места за ацетилиране или метилиране.Например, остатъци K43, K46 и K57 от H2B не участват в директното свързване на ДНК, но са мишени на различни пост-транскрипционни модификации53.По подобен начин, остатъци K44, K47 и K57 в H2B могат да играят алтернативна роля в присъствието на IFNα, включително взаимодействия с други протеини (фиг. 5A, B).В допълнение, екстрахромозомният хистон H2B активира имунния отговор в различни типове клетки, действайки като цитозолен сензор за откриване на двойноверижни ДНК (dsDNA) фрагменти, получени от инфекциозни агенти или увредени клетки54.В присъствието на ДНК вируси, изчерпването на H2B инхибира производството на IFN-β и фосфорилирането на STAT154.Известно е също, че H2B се движи навътре и извън ядрото по-бързо от други основни хистони54.H2B взаимодействия с MDN1 и LRCH4 също се наблюдават в избрани нетретирани проби.Открихме, че HLA-A взаимодейства с H2B във всичките три проби, третирани с IFNα и в една нетретирана повторна проба.Тези данни отразяват ролята на H2B в алтернативна физиологична функция, независима от регулирането на транскрипцията.
HMGA1 (група с висока подвижност AT-Hook 1), малък нуклеопротеин, богат на аминокиселини, насърчаващи заболяването, е идентифициран във връзка с HLA-A.Той има киселинна С-терминална опашка и три отделни DBDs, наречени AT куки, защото те се свързват с второстепенната бразда на AT-богатата област в dsDNA55,56.Това свързване кара ДНК да се огъва или изправя, позволявайки на каноничните транскрипционни фактори да имат достъп до нейната консенсусна последователност.Смята се, че С-терминалната опашка участва във взаимодействията протеин-протеин и набирането на транскрипционни фактори, тъй като С-терминалните делеционни мутанти не са в състояние да инициират транскрипция57.Освен това, този домейн съдържа няколко запазени места за фосфорилиране, които са известни субстрати за кинази 58 .Наблюдавахме HLA-A и H2B взаимодействия с HMGA1 извън С-терминалния домейн, което предполага, че С-терминалният домейн се използва главно за свързване на транскрипционен фактор (фиг. 5A, C).HMGA протеините се конкурират с хистон H1 за свързване към адапторна ДНК, като по този начин увеличават достъпността57.По подобен начин изглежда вероятно HMGA да взаимодейства с хистон H2B по линкерната ДНК в конкуренция с хистон H1.HMGB1 индуцира експресията на HLA-A, -B и -C в дендритни клетки, което води до тяхното активиране59, но взаимодействие между HMG и HLA не е докладвано преди това.Открихме, че HMGA1 взаимодейства с α1 и α3 домейните на HLA-A, като повечето от взаимодействията са извън неговия 3 DBD (Фигура 5A, C).Специфични адукти, измерени между H2B, HLA-A и HMGA1, са показани на Фигура 5D.
Повечето взаимодействия на HLA-A с други протеини се случват в неговите α1 и α2 домени и неподредения С-терминален домен (фиг. 6).В един от тези примери открихме, че HLA-A взаимодейства с нарушената N-терминална опашка на LRCH4 (Фигура 6A, D).LRCH4 регулира активирането на TLR4 и индукцията на LPS цитокини, като по този начин модулира вродения имунен отговор60,61.Това е мембранен протеин с девет богати на левцин повторения (LRRs) и хомологичен мотив на калмодулин (CH) в неговия ектодомен, последван от трансмембранен домен (TMD) 60, 62.Съобщава се, че СН домейните медиират протеин-протеинови взаимодействия 60 .Участък от около 300 аминокиселини между LRR и CH домейните е относително достъпен, но неподреден.Трябва да се отбележи, че нито едно от взаимодействията не включва TMJ, което предполага спецификата на подхода CLMS (Фигура 6A, B).
MDN1 също е идентифициран като част от HLA-A протеиновата мрежа (Фигура 6А).Той принадлежи към семейството на AAA протеини (ATPases, свързани с различни дейности).Това е същият N-краен AAA домейн, който се организира в хексамерен пръстен и премахва фактора на сглобяване от 60S 64 рибозомната субединица.изглежда подобен на dynein64,65,66.В допълнение, богатият на Asp/Glu регион е последван от MIDAS домейна (сайт, зависим от метални йони).Поради големия размер на MDN1 (приблизително 5600 аминокиселини) и неговата ограничена хомология с добре проучени протеини, малко се знае за неговата структура и функция при хората.Ние идентифицирахме HLA-A, H2B и LRCH4 като MDN1 свързващи партньори и разкрихме тяхната ориентация като протеинови комплекси в PyMol (фиг. 6A, B).Тези три протеина взаимодействат с AAA домейна, динеин-подобния линкерен домейн и вероятно MIDAS MDN1 домейна.В предишен доклад афинитетното пречистване на протеини на примамка идентифицира MDN1 като протеин, свързан с хистон H2B67.В допълнение, скорошно проучване също съобщава за взаимодействие между MDN и HLA-B в клетки HCT116, използвайки афинитетно пречистена масспектрометрия, подкрепяйки нашите открития68.Идентифицирането на този комплекс в проби, третирани с IFNα, предполага роля на MDN1 в сигнализирането на интерферон.
Тъй като HLA гените са силно полиморфни, ние извлякохме секвениращи четения, картографиращи HLA-A, -B и -C от данни за секвениране на РНК на Flo-1 клетки (данните не са показани).Пептидните последователности, съответстващи на разчитането на секвенцията, разкриват значителни разлики между HLA-A, -B и -C в области, където омрежените пептиди са разположени в HLA-A (Фигура S3).В допълнение, ние не наблюдавахме кръстосано свързване протеин към протеин на HLA-B/C молекули с H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 протеини.Това предполага, че протеиновото взаимодействие, открито между HLA-A, MDN1, LRCH1 и HMGA1, е HLA-A специфично.В допълнение, протеомен анализ на неомрежени проби (Таблица S4) показа, че HLA-A има по-високо покритие на последователността в сравнение с HLA-B или HLA-C.Пептидите, идентифицирани за HLA-A, са с висок интензитет както в третираните с IFNα, така и в нетретираните проби.
HLA-A взаимодействия с ендогенен MDN1 и H2B бяха открити както в третирани с IFNα, така и в нетретирани Flo-1 клетки (Фигура 7, Фигура S4).Въпреки това, нашите данни предполагат, че IFNα диференцирано регулира HLA-A свързването към H2B и MDN1.IFNα индуцира връзка между H2B и HLA-A, но намалява връзката му с MDN1.Открихме, че MDN1 е свързан с HLA-A в контролите и добавянето на IFNα намалява това взаимодействие независимо от индукцията на MDN1 от IFNα (Фигура 7B, C).В допълнение, имунопреципитацията на HLA-A улавя H2B в A549 клетки (фиг. S4), което предполага, че това взаимодействие е независимо от клетъчния тип.Взети заедно, тези резултати подкрепят интерферон-медиирани взаимодействия на HLA-A с H2B и MDN1.
HLA-A съвместно пречиства H2B и MDN1.Представителни ендогенни H2B (A) и MDN1 (B) имуноблоти бяха имунопреципитирани от третирани с IFNα Flo-1 клетки и изследвани за посочените антитела.Миши и заешки IgG се използват като отрицателна контрола.(C) Относителните количества (вход) на различни антигени са изобразени чрез имуноблоти, изследвани срещу посочените антитела, β-актинът се използва като контрола на натоварването.
Изследвани са структурните свойства на една от индуцираните от интерферон високонадеждни омрежени мрежи, H2B-HLA-A-HMGA1.Използвахме моделиране на молекулярната динамика като алтернативен подход за разбиране на конформационната динамика на протеините, включени в този комплекс (Фигура 8).Изводите от данните от CLMS предполагат възможността за различни конформации на протеините H2B, HLA-A и HMGA1.Следователно, следните потенциални комплекси бяха моделирани в среда на разтворител: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.Първоначален докинг екран протеин-протеин, използващ пакета MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Монреал, Квебек, Канада), предложи възможни конформации, които се различават между тези протеини (фиг. 8А).Визуализацията на докинг протеиновия комплекс разкрива няколко взаимодействия и възможни конформации (Фигура 5А, 8).По този начин, една възможна конформация е показана на Фигура 8А (с обозначени напречни връзки) и тя беше допълнително оценена с помощта на тръбопровода за моделиране на MD.В допълнение, свързването на H2B или HMGA1 към HLA-A подчертава по-високия афинитет на H2B към HLA-A (фиг. 8A).
Конформационна динамика на възможните мрежи между комплексите H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.В допълнение, идентифицираните омрежващи остатъци са белязани върху структурите на протеините H2B, HLA-A и HMGA1.Свързаните конформации на тези протеини бяха извлечени с помощта на докинг тръбопровода, внедрен в пакета MOE.Долният ляв панел показва различните възможни конформации на комплексите H2B-HLA-A и HMGA1-HLA-A с различни афинитети на свързване протеин-протеин (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Стандартно отклонение (RMSD) на атомните позиции (с изключение на водородните атоми) за всяка протеинова структура.(C) Междумолекулни взаимодействия протеин-протеин на водородна връзка от различни симулирани комплекси, като се вземат предвид специфични взаимодействия с продължителност ≥ 10 ns.Разстоянието на прекъсване на h-връзката донор-акцептор беше зададено на 3, 5 Å, а ъгълът на прекъсване на донор-H-акцептор беше зададен на ≥ 160°–180°.(D) Белязани остатъци, образуващи HLA-A протеин-протеинови взаимодействия със съответните им партньори, обхващащи ≥ 20 ns, извлечени от фиктивни HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1 комплекси.Протеиновите структури представляват средна структура от 100 ns MDS.(E) Взаимодействия между HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1 комплекси в сравнение с взаимодействията, проследени от H2B-HLA симулация над 100 ns въз основа на K или S мястото на взаимодействие между двата пептида.Комплекси /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Праговата стойност за оценка на кръстосаните връзки беше зададена на 3.0 и бяха взети предвид специфични взаимодействия от MDS, вземащи ≥ 10 ns.Протеиновите структури бяха визуализирани с помощта на пакети BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., Сан Диего, Калифорния, САЩ) и Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреал, Квебек, Канада).
Стабилността на HLA-A молекулите във времето (стандартно отклонение; RMSD или стандартно отклонение; RMSF) показва, че присъствието на H2B или HMGA1 протеини в комплексите стабилизира HLA-A (Фигура 8B, Фигура S5).Протеинът HMGA1 се свързва плътно с B2M мястото на HLA-A, предизвиквайки стабилността на HLA-A аминокиселините в комплекса HLA-A-HMGA1 или H2B-HLA-A-HMGA1 (Фигура 8B, Фигура S5).по-специално, HLA остатъци ~60-90 и ~180-210 се оказаха по-малко гъвкави в присъствието на H2B (ФИГ. 8В).H2B и HMGA1 показват по-добро свързване към HLA-A в комплекса H2B-HLA-A-HMGA1 в сравнение със свързването на HLA-A към H2B или HMGA1 самостоятелно (Фигура 8C, D; Таблица S5).Остатъците, участващи във водородното свързване (MD моделирана висока заетост ≥ 10 ns) съвпадат с местата на взаимодействие на CLMS (K или S остатъци) в комплекса, което предполага, че взаимодействията, идентифицирани от CLMS, са много надеждни.Надеждност (фиг. 8E).При CLMS и MD моделиране, беше установено, че HLA-A остатъци между около 190-210 и около 200-220 аминокиселини свързват съответно H2B и HMGA1 (ФИГ. 8E).
Взаимодействията протеин-протеин образуват динамични структурни мрежи, които медиират вътреклетъчната комуникация в отговор на определени стимули.Тъй като много подходи на протеомиката откриват промени в общото ниво на стабилно състояние на протеин, динамиката на взаимодействие протеин-протеин изисква допълнителни инструменти за улавяне на интерфейсите на свързване и CLMS е един такъв инструмент.Интерфероновата сигнална система е цитокинова мрежа, която позволява на клетките да реагират на набор от патогенни и присъщи патологични сигнали на околната среда, кулминирайки в индуцирането на подгрупи от интерферон-индуцируеми протеини.Приложихме CLMS, за да определим дали могат да бъдат идентифицирани нови протеин-протеинови взаимодействия сред панел от протеини, индуцирани от интерферон.Глобалният протеинов омрежващ анализ в интерферон-чувствителен Flo-1 клетъчен модел беше използван за улавяне на протеинови комплекси.Екстракцията на триптични пептиди от не-омрежени и омрежени клетки позволява преброяване на пептиди, обогатяване на пътя и разпределение на дължината на пептида с определен интензитет на LFQ.Каноничните интерферон-индуцируеми протеини бяха идентифицирани като положителна вътрешна контрола, докато бяха наблюдавани нови междумолекулни и вътрешномолекулни омрежени адукти на канонични интерферон-индуцируеми протеини като MX1, UP18, OAS3 и STAT1.Изследвани са различни структурни характеристики и взаимодействия във функционални области.
Взаимодействие между HLA-A, MDN1 и H2B беше открито чрез имуноблотинг във Flo-1 и A549 клетки, третирани и нетретирани с IFNα.Нашите резултати подчертават, че HLA-A се комплексира с H2B по IFNα-зависим начин.Нашата работа представлява интересен път за по-нататъшно изследване на съвместната локализация на тези два комплекса.Също така би било интересно да се разшири подходът на CLMS към панел от клетъчни линии, за да се идентифицират независими от клетъчния тип интерферон-медиирани протеинови взаимодействия.Изводите от данните от CLMS предполагат възможността за различни конформации на протеините H2BFS, HLA-A и HMGA1.Възможните различни конформации между тези докинг протеинови комплекси разкриха няколко взаимодействия, подобни на тези, наблюдавани в набора от данни CLMS.
Flo-1 клетки бяха получени от ATCC и поддържани в DMEM (Gibco), допълнен с 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen), 10% фетален волски серум (Gibco) и съхранявани при 37°C и 5% CO2.Инкубация.Клетките се отглеждат до 70-80% сливане преди да бъдат третирани с IFNα14 (произведен от Edinburgh Protein Production Facility).Всички други химикали и реактиви са закупени от Sigma Aldrich, освен ако не е отбелязано друго.
Flo-1 клетки се култивират в 6-ямкови плаки и на следващия ден клетките се третират с 10 ng/ml IFNα14 за 24 часа до приблизително 80% сливане.Клетките се промиват три пъти с PBS и се лигират с прясно приготвен DSS (Thermo Fisher Scientific) (разтворен в DMSO) в PBS за 5 минути при 37°С до крайна концентрация от 0.5 тМ.DSS омрежващата реакция беше заменена с PBS и остатъчният DSS беше потушен чрез добавяне на 20 mM Tris (рН 8.0) в PBS за 15 min при 37°C.Клетките се събират чрез изстъргване и се събират в епруветки с ниско свързване (Axygen).
Всички етапи на центрофугиране се извършват при 14,000 xg при 8°C.Центрофугирайте лизата за 10 минути и прехвърлете супернатантата в нова епруветка.Останалите бистри частици се разтварят в 150 μl от втория лизисен буфер (2 М урея, 2% (w/v) SDS (натриев додецил сулфат)) за 30 минути или повече, докато се получи хомогенен воден разтвор.Лизатът се центрофугира в продължение на 20 минути и супернатантата се смесва с лизата, получен в предишния етап.Концентрациите на протеин се оценяват с помощта на Micro BCA анализ (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя за процедурите на микроплаки.Пробите бързо се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80°C.
69 Накратко, протеинът се омрежва с 200 µl уреен буфер (8 М урея в 0,1 М Tris, рН 8,5), разбърква се на вортекс и се разполовява.Всички етапи на центрофугиране се извършват при 14,000 xg при 25°C.Първата половина от омрежения протеинов лизат се прехвърля в 10 kDa центрофужно филтърно устройство Microcon, оборудвано с мембрана Ultracel-10 (Merck), последвано от центрофугиране върху филтъра за 25 минути.След това добавете втората половина от протеина към филтъра и повторете същите стъпки.Възстановяването на протеин се извършва чрез добавяне на 100 μl от 17 mM трис (2-карбоксиетил) фосфин хидрохлорид (TCEP) в уреен буфер.Възстановяването се разбърква в термомиксер при 600 rpm в продължение на 30 минути при 37°С.В допълнение, колоната се центрофугира и редуцираният омрежен протеин се алкилира при използване на 100 μl от 50 тМ йодоацетамид в уреен буфер.Реакцията на алкилиране се провежда при стайна температура в продължение на 20 минути на тъмно.Завъртете колоната, измийте стените на колоната 3 пъти със 100 µl уреен буфер и след това центрофугирайте.Същата операция се извършва 3 пъти, като се използват 100 μl 100 mM амониев бикарбонат.Преди трипсинизация сменете събирателната епруветка с нова.Добавете буфер за смилане, съдържащ 50 mM амониев бикарбонат и 1 µl трипсин, разреден в трипсинов буфер (Promega).Съотношението на трипсин към протеин се поддържа при около 1:33 и реакциите на смилане се инкубират една нощ при 37°С във влажна камера.Омреженият пептид се елуира от филтъра чрез центрофугиране в продължение на 25 минути.Възстановяването на пептида се подобрява чрез добавяне на 50 μl от 0,5 М NaCl към филтъра, последвано от центрофугиране за 25 минути.
Накратко, С18 въртящи се колони се активират с три промивания на 0.1% мравчена киселина (FA) в ацетонитрил (AcN) (Merck) и две промивания на 0.1% FA.Колоната се хидратира с 0.1% FA за 15 минути.Заредете пробите в въртящи се колони и промийте 3 пъти с 0,1% FA.Обезсолените пептиди се елуират последователно със стъпаловиден градиент, използвайки 50%, 80% и 100% AcN в 0.1% FA.Пробите се сушат в концентратор SpeedVac Plus (Eppendorf), докато остатъчната течност изчезне напълно.Приблизително 1 μg омрежен пептид на проба се инжектира в LC-MS/MS системата.
Омрежените пептиди бяха разделени на UltiMate 3000 RSLCnano LC система (Thermo Scientific), свързана с Orbitrap Exploris 480 масспектрометър (Thermo Scientific).Омрежени пептиди бяха събрани на 300 µm ID, 5 mm дълга µ-предколона C18 улавяща колона, напълнена с C18 PepMap100 сорбент и 5 µm PepMap сорбент (Thermo Scientific).Заредете дебита на помпата при 5 µl/min 0,08% трифлуорооцетна киселина, разтворена в 2,5% AcN.Омрежените пептиди се разделят на аналитична кондензирана силициева колона с вътрешен диаметър 75 μm и дължина 150 mm, напълнена с 2 μm PepMap сорбент (Thermo Scientific).Мобилните фази А и В се състоят съответно от 0.1% FA във вода и 0.1% FA в ацетонитрил.Съставът на подвижната фаза се поддържа при 90% В за 10 минути и след това намалява линейно до 2,5% В за 2 минути.Колоната се еквилибрира при 2,5% В за 8 минути преди следващия цикъл.Омрежените пептиди, елуирани от аналитичната колона, се йонизират в източник на наноелектроспрей йонизация (NSI) и се инжектират в масспектрометър Exploris 480 (Thermo Scientific).
Масспектрометърът Orbitrap Exploris 480 работи в режим на корелация на положителни данни.Беше извършено пълно сканиране в режим на разрез при разделителна способност от 120 000 с настройки на обхвата от m/z 350 Th до m/z 2000 Th.Нормализираната цел на AGC беше зададена на 300% с максимално време за въвеждане от 50 ms.Установено е откриване на моноизотопни пикове за пептиди.Параметърът за релаксация на ограничението е зададен на true, ако са намерени твърде малко прекурсори.
Времето на цикъл между основните сканирания в режим на корелация на данни беше зададено на 2,5 секунди.Динамичното масово изключване беше настроено на 20 s след първото фрагментиране на прекурсорния йон.Прозорецът за изолиране на прекурсора беше настроен на 2 Th.Типът нормализирана енергия на сблъсък с режим на фиксирана енергия на сблъсък беше избран в зависимо от данните MS/MS сканиране.Енергията на сблъсък е зададена на 30%.Разделителната способност на Orbitrap беше зададена на 15 000, а целта на AGC на 100%.
Преди да проследим мрежата протеин-протеин в омрежени проби, ние обработихме необработените файлове с помощта на пакета MaxQuant (версия 1.6.12.0) 26, 27, за да идентифицираме проследими пептиди/протеини в пробите.В допълнение, подобни протеомни анализи бяха извършени върху неомрежени Flo-1 проби, третирани и нетретирани с IFNα.Данните за MS/MS бяха търсени в базата данни за хора UniProt (www.uniprot.org) (качена на 12 август 2020 г., съдържа 75 093 записа) с помощта на вградената търсачка Andromeda27.Първоначалното и максимално отклонение на масата беше зададено на 10 ppm.Допълнителен статистически анализ беше извършен с помощта на програмата Perseus (версия 1.6.10.45).Съдържанието на протеин се изчислява чрез нормализиране на спектралния интензитет на протеина (LFQ интензитет; небелязано количествено определяне)27 и стойностите на интензитета се преобразуват в Log2.Анализът на обогатяване на пътя беше извършен с помощта на базата данни на пътя на Reactome за третирани с IFNα протеини, които бяха повече от четири пъти активирани в сравнение с нетретирани проби.
Идентифициране на лизин (K) или серин (S) специфични химически омрежвания на протеинови комплекси, наблюдавани от LC-MS/MS, се извършва с помощта на машина за спектроскопска идентификация (SIM-XL) за омрежени пептиди (SIM-XL)29.Първо, възможните взаимодействия между свързаните с интерферон (IFN) гени за резистентност към увреждане на ДНК (IRDS) бяха изследвани с помощта на набора от данни за IRDS протеин, описан в Padariya et al.28.Скринингът на всички състояния и повторения на целия човешки UniProt изисква много изчисления, така че цялата база данни UniProt за хора (www.uniprot.org) (изтеглена на 12 август 2020 г., съдържа 75 093 записа) срещу третирани с IFNα повторения.Един от филтрите за взаимодействия с високо доверие.
В SIM-XL, DSS беше използван за омрежващия агент (XL) и XL тегловното изместване и модификационното тегловно изместване бяха настроени съответно на 138.06 и 156.07.Разглеждат се следните реакционни места на омрежване: KK, KS и KN-TERM, без репортерни йони.Както прекурсорът, така и фрагментът ppm бяха зададени на 20 и прагът на Xrea беше зададен на 0,15.Трипсинът се счита за напълно специфичен и е приложен високоенергиен C-trap (HCD) фрагментационен метод.Други параметри са: моноизотопна вероятност и прекъсване на пиковите съвпадения, минимум 4 AA остатъка на верига и максимален заряд на веригата и 3 максимума на пропуснатите разделяния.
Структурите на протеиновия модел са създадени с помощта на сървъра Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11, използвайки принципите на моделиране на хомология и прилагане на „Скрития метод на Марков“.Phyre2 генерира моделни структури въз основа на подравняване на последователността с известни протеинови структури.За H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 и MDN1 протеини бяха използвани шаблонни структури 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 и 6i2665.Освен това беше взета предвид и структурата на AlphaFold71 MX1, UBP18 и ROBO1.Структурата на протеина беше визуализирана с помощта на пакета BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и пакета Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреал, Квебек, Канада).