ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплексна заварена тръба за химичен компонент за химическата промишленост. Дефицитът на SPECC1L води до повишена стабилност на снадените стави и намалено отделяне на клетки от черепния нервен гребен.

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Използвате версия на браузър с ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплексна заварена тръба за химическата промишленост

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.е водещ производител, който е специализиран в безшевни тръби от неръждаема стомана, ярко закалени тръби, безшевни спираловидни тръби и др.За улеснение на клиентите имаме и заварени тръби.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.има най-модерното оборудване за производство и тестване.Можем напълно да задоволим вашите изисквания.Съгласно стандарта много стриктно, тръбите, които произвеждаме от нас, винаги имат точен толеранс на OD и WT.Контролът на толерантността е строго в съответствие със стандартите за производство.Нашите продукти винаги са доволни от клиентите.Клиентите, закупили нашите продукти, създадоха повече печалби.
a) OD (външен диаметър): 3,18 mm до 101,6 mm
b) WT (дебелина на стената): 0,5 mm до 20 mm
в) Дължина: Според изискванията на клиента
d) Стандарти: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 и др
д) Метод на процеса: ERW, EFW и др

Плъзгачи, показващи три статии на слайд.Използвайте бутоните за връщане назад и напред, за да се движите през слайдовете, или бутоните за управление на плъзгачите в края, за да се движите през всеки слайд.
Клетките на черепния нервен гребен (CNCC) се отделят от ембрионалните нервни гънки и мигрират към фарингеалните дъги, които образуват повечето структури на средната част на лицето.Дисфункцията на CNCC играе важна роля в етиологията на орофациалната цепнатина, често срещана вродена малформация.Хетерозиготни SPECC1L мутации са открити при пациенти с атипични и синдромни цепнатини.Тук докладваме засилено оцветяване на компоненти на канонично адхезивно съединение (AJ), β-катенин и E-кадхерин в култивирани нокдаун клетки SPECC1L, а електронните микрографии показват апикално-базална дифузия на AJ.За да разберем ролята на SPECC1L в краниофациалната морфогенеза, създадохме модел на мишка с дефицит на Specc1l.Хомозиготните мутанти са летални за ембриона и показват нарушено затваряне на невралната тръба и CNCC ламиниране.Оцветяването на AJ протеин се увеличава в мутантните неврални гънки.Този AJ дефект е в съответствие с дефект в разслояването на CNCC, изискващ разтваряне на AJ.В допълнение, Specc11 мутанти имат намалено PI3K-AKT сигнализиране и повишена апоптоза.In vitro, леко инхибиране на PI3K-AKT сигнализация в клетки от див тип беше достатъчно, за да предизвика промени в AJ.Важно е, че промените в AJ, предизвикани от нокдаун SPECC1L, могат да бъдат обърнати чрез активиране на пътя PI3K-AKT.Взети заедно, тези данни предполагат, че SPECC1L, като нов регулатор на PI3K-AKT сигнализация и AJ биология, е необходим за затваряне на невралната тръба и стратификация на CNCC.
Клетките на черепния нервен гребен (CNCCs) се локализират в дорзалната невроектодерма и се отделят от невроепителия на развиващите се нервни гънки чрез процес, включващ епителен-мезенхимален преход (EMT) 1,2,3.Премигриращите епителни CNCC разрушават междуклетъчните връзки и се превръщат в мигриращи мезенхимни CNCC, които изпълват първата и втората фарингеална дъга и образуват по-голямата част от краниофациалния хрущял.По този начин гените, които регулират функцията на CNCC, често се нарушават в етиологията на краниофациалните вродени аномалии като орофациални цепнатини, които най-често засягат 1/800 раждания само в САЩ.Една от вродените деформации8.
Деламинирането на CNCC съвпада със затварянето на предната неврална тръба между 8,5 и 9,5 дни от ембрионалното развитие при мишки.Мутанти на редица миши гени, свързани с орофациална цепнатина, също показват някаква форма на дефект на невралната тръба, включително Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 и Pdgfrα12.Въпреки това, процесите на затваряне на невралната тръба и стратификацията на CNCC могат да се считат за независими, тъй като мутантната мишка Splotch (Pax3) проявява дефекти в затварянето на невралната тръба без никакъв ефект върху стратификацията или миграцията на CNCC 13,14.Допълнителни миши модели с дефекти в дисекцията на CNCC и затварянето на невралната тръба ще помогнат да се очертае общата молекулярна основа на тези два процеса.
Изолирането на CNCC от невроепителните клетки изисква разтваряне на адхезивни връзки (AJs), които са съставени от протеинови комплекси, съдържащи, наред с други, Е-кадхерин, β-катенин, α-E-катенин и α-актинин, свързани с актинови филаменти 2 Изследванията за свръхекспресия на Е-кадхерин в невралните гънки показват намаляване или забавяне на разслояването на CNCC.Обратно, потискането на Е-кадхерин води до ранна стратификация15,16.Много от факторите, които медиират EMT по време на стратификацията на CNCC, са транскрипционни фактори (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) и протеини за ремоделиране на извънклетъчния матрикс (ECM), като матрични металопротеинази (MMP), но CNCC са директни цитоскелетни регулатори на AJ. все още не е известно.Известно е, че пътят на PI3K-AKT антагонизира нивата на Е-кадхерин, главно от изследвания на рака17.Последните проучвания показват, че загубата на базирано на PDGFα PI3K-AKT сигнализиране при мишки води до краниофациални аномалии, включително цепнато небце и дефекти на невралната тръба12.Въпреки това, връзката между пътя на PI3K-AKT и стабилността на AJ при стратификация на CNCC е неясна.
По-рано идентифицирахме SPECC1L като първия мутантен ген при двама души с тежка цепнатина, която се простира от устата до окото, известна като наклонена цепнатина (ObFC) или Tessier IV18 цепнатина.SPECC1L мутации са идентифицирани в две многогенерационни семейства с автозомно доминантен синдром на Opitz G/BBB (OMIM #145410), при които засегнатите индивиди показват хипердистанция и цепнатина на устната/небцето19, и в едно семейство със синдром на свръхдистанция на Tibi (OMIM #145420)20 .повече от половината от случаите на синдром на Opitz G/BBB са Х-свързани (OMIM #300000) и са причинени от мутации в гена MID1, който кодира протеин 22 на свързания с микротубулите клетъчен скелет.Ние предполагаме, че SPECC1L, също протеин, свързан с микротубулите и актиновия цитоскелет, може да медиира сигнализирането, необходимо за ремоделиране на актиновия цитоскелет по време на клетъчна адхезия и миграция 18.Чрез in vitro и in vivo проучвания сега описваме SPECC1L като нов регулатор на стабилността на AJ чрез PI3K-AKT сигнализиране.На клетъчно ниво, дефицитът на SPECC1L доведе до намаляване на нивото на пан-AKT протеина и увеличаване на апикално-базалната дисперсия на AJ, което беше елиминирано чрез химическо активиране на AKT пътя.In vivo, ембрионите с дефицит на Specc11 показват нарушено затваряне на невралната тръба и намалена дисекция на CNCC.По този начин SPECC1L функционира в силно регулирана сигнализация, базирана на клетъчна адхезия, необходима за нормалната функция на CNCC по време на морфогенезата на лицето.
За да характеризираме ролята на SPECC1L на клетъчно ниво, използвахме описаната по-рано стабилна остеосаркомна клетъчна линия U2OS с дефицит на SPECC1L18.Тези стабилни U2OS клетки с SPECC1L (kd) нокдаун имат умерено (60–70%) понижение на нивата на SPECC1L транскрипти и протеини, заедно с дефекти в миграцията и реорганизацията на актиновия цитоскелет 18. За разлика от това, силно преходно намаление на Доказано е, че SPECC1L води до митотични дефекти 23.При по-нататъшно характеризиране открихме, че нашите стабилни SPECC1L-kd клетки променят морфологията при много висока степен на сливане (Фигура 1).Индивидуалните контролни клетки и kd клетките при ниско сливане изглеждаха подобни (Фигура 1A, D).24 часа след сливането, контролните клетки запазват своята кубоидална форма (Фиг. 1B, E), докато SPECC1L-kd клетките се удължават (Фиг. 1C, F).Степента на тази промяна във формата на клетката беше уловена чрез in vivo изображения на живо на контролни клетки и kd клетки (филм 1).За да определим ролята на SPECC1L в конфлуентни клетки, първо изследвахме неговата експресия.Открихме, че нивата на SPECC1L протеин се повишават при сливане (Фигура 1G), докато нивата на SPECC1L транскрипт не се повишават (Фигура 1H).В допълнение, с увеличаването на клетъчната плътност, протеинът SPECC1L се натрупва в междуклетъчните граници (Фиг. 2A-E), с модел, припокриващ се с този на свързания с мембраната β-катенин (Фиг. 2A'-E').Като се има предвид връзката на SPECC1L с актиновия цитоскелет 18, 23, ние предположихме, че SPECC1L взаимодейства с базирани на актин адхезивни връзки (AJ).
(AF) SPECC1L нокдаун (DF) клетките се удължават при високо сливане (F) в сравнение с контролните U2OS клетки (AC).Тук са показани три от шестте времеви точки (T1, T3, T6), които избрахме за различна плътност на клетките.(G) Western blot анализ, показващ, че протеинът SPECC1L е стабилизиран при висока степен на сливане в сравнение с ниска степен на сливане в контролните клетки.Western blot на SPECC1L показва очакваната лента от 120 kDa и лента с по-високо молекулно тегло, вероятно пост-транслационно модифицирана (*).Анализът на Western blot се извършва при същите условия за ниско и високо сливане.Изображения, показващи SPECC1L при ниско и високо сливане, бяха взети от едно и също петно.Същото петно ​​беше отстранено и повторно изследвано с β-актиново антитяло.(H) Количественият RT-PCR анализ не показа значителни промени в нивата на SPECC1L транскрипт.Лентите за грешки представляват SEM от четири независими експеримента.
(AE) Избрахме шест времеви точки (T1-T6), представляващи диапазон от клетъчни плътности, за да нормализираме анализа на клетъчната форма и промените на AJ в U2OS клетки с нокдаун SPECC1L (kd).Първите пет от тези времеви точки включват единични клетки (T1), 50-70% сливане на малки клетъчни клъстери (T2), сливане без преоформяне на kd клетки (T3), преоформяне на kd клетки (T4) и 24-часови промени.в задната форма на kd (T5) клетки.Протеинът SPECC1L се диспергира предимно в цитоплазмата при T1 (A), но натрупването му се наблюдава на междуклетъчните граници в следващите времеви точки (B–E, стрелки).(FJ) β-катенинът показва подобно натрупване в междуклетъчните граници, свързани с AJ комплекса.(A'-E') SPECC1L и β-катенин показват припокриващо се оцветяване по клетъчните граници при висока клетъчна плътност (стрелки).(F'-J') В SPECC1L-kd клетки, оцветяването с β-катенин изглежда нормално при ниска клетъчна плътност (F'-H'), но се разширява при промяна на формата на клетката (I', J'; стрелки), което показва, че AJ са се променили.Стълбчета = 10 µm.
След това се опитахме да определим ефекта от дефицита на SPECC1L върху AJ.Използвахме няколко маркера, свързани с AJ, включително каноничните компоненти F-актин, миозин IIb, β-катенин и E-кадхерин 24, 25, 26, 27.Актиновите стресови влакна се увеличават в SPECC1L-kd клетки, както е описано по-рано (Фиг. 3A, B) 18.Миозин IIb, свързан с актинови филаменти, показва подобно увеличение на SPECC1L-kd клетки in vitro (фиг. 3C, D).Свързаният с AJ β-катенин се свързва с кадхерин в клетъчната мембрана, показвайки нормален модел на експресия на "пчелна пита" в контролните кубоцити (фиг. 3E, G).Интересното е, че в плоски изображения, използващи конфокална микроскопия, оцветяването с β-катенин (Фиг. 3E, F) и E-кадхерин (Фиг. 3G, H) върху клетъчната мембрана на конфлуентни SPECC1L-дефицитни клетки показва видни модели на разширено оцветяване.Това разширяване на свързаното с AJ оцветяване с β-катенин в kd клетки е най-изразено при сливане, но изглежда предшества промените във формата на клетката (фиг. 2F-J, F'-J').За да определим физическата природа на това разширено AJ оцветяване, ние изследвахме клетъчните граници на апикално-базалната повърхност на SPECC1L-kd U2OS клетки чрез трансмисионна електронна микроскопия (TEM) (Фигура 3I,J).За разлика от контролните клетки (Фиг. 3I), които имат отделни области с електронна плътност, показателни за AJ (стрелки), kd клетките (Фиг. 3J) показват големи, съседни области с висока електронна плътност, показателни за AJ по апикобазалната равнина..В допълнение, на напречни срезове, наблюдавахме обширни гънки на клетъчната мембрана в kd клетки (Фиг. S1A, B), което обяснява разширения модел на ленти за оцветяване на β-катенин и Е-кадхерин (Фиг. 3F, H).В подкрепа на ролята на SPECC1L в AJs, β-катенинът беше ко-имунопреципитиран със SPECC1L в лизати на конфлуентни U2OS клетки (фиг. 3K).Заедно с разширеното имунооцветяване за AJ маркери, ТЕМ анализът беше в съответствие с нашата хипотеза, че дефицитът на SPECC1L увеличава апикално-базалната плътност и вариация на AJ.
(AH) Повишено оцветяване с F-актин в kd клетки 48 часа след сливането (T6; A, B).Променено оцветяване на миозин IIb, свързано с F-актин (C, D).Гладкият модел на оцветяване на мембраната с β-катенин и Е-кадхерин в контролните клетки (E, G) беше подобрен в SPECC1L-kd (F, H) клетки.Стълбчета = 10 µm.(I–J) Електронни микрографии, наблюдаващи апикално-базалното междуклетъчно съединение.Контролните клетки показват различни електронно-плътни области, показващи лепкави връзки (I, стрелки).За разлика от това, цялата апикално-базална връзка в SPECC1L-kd клетките изглежда плътна с електрони (J, стрелки), което показва повишена плътност и дисперсия на адхезивните връзки.(K) β-катенинът беше ко-имунопреципитиран със SPECC1L в конфлуентни U2OS клетъчни лизати.Изображение, взето от едно място, представляващо един от четири независими експеримента.
За да разберем ролята на SPECC1L в краниофациалната морфогенеза, ние създадохме модел на мишка с дефицит на Specc1l, използвайки две независими клетъчни линии ES trap, DTM096 и RRH048 (BayGenomics, Калифорния), които представляват интрон 1 и Specc1l транскриптите бяха уловени на 15 (фиг. 1) .4A, фигура S2).Геномното местоположение на вложката на вектора за примамка се определя чрез секвениране на целия геном и се потвърждава от PCR (фиг. S2).И двата дизайна на генни капани също позволяват сливане в рамка на репортерите Specc11-lacZ при улавяне.Следователно експресията на lacZ, определена чрез оцветяване с X-gal, се използва като индикатор за експресията на Specc11.И двата алела показват подобни модели на експресия на lacZ, като DTM096 генният капан в интрон 1 показва по-силна експресия от RRH048 в интрон 15 (не е показано).Въпреки това, Specc1l е широко експресиран, с особено силна експресия в невралните гънки при E8.5 (Фигура 4B), в невралната тръба и лицевите израстъци при E9.5 и E10.5 (Фигура 4C, D) и в развиващите се крайници на Е10.5 и очи (Фигура 4D).По-рано докладвахме, че експресията на SPECC1L в първата фарингеална дъга при E10.5 присъства в епитела и подлежащия мезенхим18, в съответствие с CNCC линията.За да тестваме експресията на SPECC1L в CNCC, направихме E8.5 невронни гънки (Фигура 4E-J) и E9.5 секции на черепа (Фигура 4K-).При E8.5, SPECC1L оцветява интензивно невралните гънки (Фиг. 4E, H), включително клетки, оцветени с NCC маркери (Фиг. 4G, J).При E9.5, SPECC1L (Фиг. 4K, N) силно оцветява мигриращи CNCC, оцветени съвместно с AP2A (Фиг. 4L, M) или SOX10 (Фиг. 4O, P).
(A) Схематично представяне на мишия Specc11 ген, показващ вмъкване на примамващ вектор в ES DTM096 (интрон 1) и RRH048 (интрон 15) клетъчни клонове.(BD) lacZ оцветяване на хетерозиготни Specc1lDTM096 ембриони, представляващи Specc1l експресия от E8.5 до E10.5.NE = невроектодерма, NF = неврална гънка, PA1 = първа фарингеална дъга.(EP) SPECC1L имунооцветяване с NCC маркери AP2A и SOX10 в E8.5 (NF; EJ) неврални гънки и E9.5 (KP) срезове на черепа.Оцветяването със SPECC1L се наблюдава широко в неврални гънки E8.5 (E, H; върхове на стрелки), включително клетки, маркирани с AP2A (F, G; върхове на стрелки) и SOX10 (I, J; върхове на стрелки).При E9.5, SPECC1L силно оцветени мигриращи CNCC (K, N; стрелки), означени с AP2A (L, M; стрелки) и SOX10 (O, P; стрелки).
Кръстосването между хетерозиготни Specc1lDTM096/+ и Specc1lRRH048/+ мишки показва, че двата алела на генния капан не са комплементарни и че съставните хетерозиготи и ембрионалните хомозиготи за всеки алел на генния капан са летални за ембриона (Таблица S1).Менделските съотношения показват намаляване на степента на преживяемост на хетерозиготите при раждане (очаквано 1,34 срещу 2,0).Отбелязахме ниска перинатална смъртност сред хетерозиготите, някои имаха краниофациални аномалии (фиг. S3).Въпреки това, ниското проникване на тези перинатални краниофациални фенотипове затруднява изучаването на техните основни патофизиологични механизми.Следователно, ние се фокусирахме върху ембрионалния летален фенотип на хомозиготни Specc11 мутанти.
Повечето комбинирани хетерозиготни или хомозиготни Specc1lDTM096/RRH048 мутантни ембриони не са се развили след E9.5–10.5 (Фигури 5A–D) и невралната тръба не се затваря отпред (Фигури 5B, D) и понякога се затваря отзад (не е показано) ..Този дефект на затваряне на черепната неврална тръба е свързан с по-голямата част от CNCC маркирания DLX2, оставащ в невралните гънки при E10.5, което показва липса на дисекция (Фигура 5A'-D').За да определим дали общият размер на CNCC също е намален, ние маркирахме CNCC линии с GFP в нашите генни капани с Wnt1-Cre и ROSAmTmG.Ние предаваме сортирани GFP+ NCC и GFP- (RFP+) не-NCC от цели ембриони.При E9.5 делът на сортираните по поток GFP-маркирани CNCCs не се променя значително между WT и мутантните ембриони (не са показани), което показва нормална спецификация на CNCC.Следователно, ние предположихме, че остатъчното оцветяване с Wnt1-Cre и DLX2 в откритите неврални гънки (Фигура 5B') се дължи на дефектно наслояване на CNCC, вероятно поради повишена плътност или дисперсия на AJ клетки, както се вижда в SPECC1L-kd клетки.Използвахме NCC маркерите SOX10, AP2A и DLX2, за да потвърдим наличието на CNCC в невралната гънка (Фигура 5E-R).При E8.5 се наблюдава оцветяване на невралната гънка за трите NCC маркера в секции на WT (Фиг. 5E, G, I) и Specc1l мутант (Фиг. 5F, H, J).При E9.5, докато NCC маркерите оцветяват мигриращия NCC в WT секции (Фиг. 5M, O, Q), остатъчното NCC оцветяване се наблюдава в открити неврални гънки на Specc1l мутантни ембриони (Фиг. 5N, P, R).Тъй като SOX10 и DLX2 маркират мигриращи CNCC, този резултат предполага, че CNCC с дефицит на SPECC1L постигат спецификация след миграция, но не успяват да мигрират от нервните гънки.
Дефицитът на Specc11 води до дефектно затваряне на невралната тръба, разслояване на клетките на черепния нервен гребен и AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Ембрион, носещ мигриращи клетки на черепния нервен гребен (CNCC), белязани с Wnt1-Cre (A').Обратно, Specc11 мутантните ембриони показват отворени нервни гънки (B), върхове на стрелки) и CNCC, които не са мигрирали (B', върхове на стрели).(C, D') Изображения в ярко поле (C, D') и имунооцветяване (C', D') на CNCC маркер DLX2 на E10.5 WT ембриони (C, C') и Specc1l (D, D').В ембриони WT E10.5 DLX2-позитивните CNCC колонизират хрилните дъги (C', стрелки), докато при мутанти видимото оцветяване продължава в отворените неврални гънки (D', стрелки) и в първите фарингеални дъги (D', стрелки).) с известно оцветяване (стрелки), показващо лошо разслояване и миграция на CNCC.ER) Секции от WT и Specc1l мутантни ембриони на етапи E8.5 (E–L) и E9.5 (M–R) бяха белязани с NCC маркери SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) и DLX2 (I, J, Q, R).При E8.5 се наблюдава оцветяване с NCC в нервна гънка от див тип (NF) и мутантни секции.Съвместното оцветяване на SOX10 и β-катенин в E8.5 WT (K) и мутант (L) разкрива повишено оцветяване с β-катенин на клетъчните граници в невралните гънки.При E9.5 се наблюдава оцветяване от див тип на мигриращи CNCCs (M, O, Q), докато при мутанти нестратифицираните CNCCs оцветяват отворени неврални гънки (N, P, R).(S–Z) In vivo анализ на маркиране на AJ в коронарни участъци на ембриони WT и Specc11DTM096/RRH048 с мутация E9.5.В горния десен ъгъл е показана приблизителна равнина на сечение.В участъци от мутантни тъкани се наблюдава повишено оцветяване на F-актин (S, T) и миозин IIb (U, V).Подобно на in vitro резултатите на Фиг. 3, при мутантни ембриони се наблюдава засилено оцветяване на мембраната за β-катенин (W, X) и E-кадхерин (Y, Z).(AA-BB) Електронна микроснимка на секция от ембрион от див тип, гледаща отвъд границата на апикално-базалната клетка, показва отчетлива електронно плътна област, показателна за адхезивни връзки (AA, стрелки).Обратно, в участъци от Specc11 мутантни ембриони (BB, стрелки), цялото апикобазално съединение е електронно плътно, което показва повишена плътност и дисперсия на адхезивни връзки.
За да тестваме нашата хипотеза, че намаленото наслояване се дължи на променен AJ, ние изследвахме AJ маркирането в открити неврални гънки на Specc1l мутантни ембриони (фиг. 5S-Z).Наблюдавахме увеличаване на влакната на актиновия стрес (Фигура 5S, T) и съпътстваща повишена локализация на оцветяването на миозин IIB върху актинови влакна (Фигура 5U, V).Важно е, че наблюдавахме повишено оцветяване на β-катенин (Фиг. 5W, X) и E-кадхерин (Фиг. 5Y, Z) на междуклетъчните граници.Ние също така изследвахме оцветяването с β-катенин на NCC в невралните гънки на ембриони E8.5 (фиг. 5K, L).Оцветяването с β-катенин изглежда е по-силно в Specc1l мутантните нервни гънки (фиг. 5L и K), което предполага, че промените в AJ са започнали.В електронни микрографии на срезове на черепа на ембриони E9.5, ние отново наблюдавахме повишено дифузно електронно-плътно оцветяване в Specc1l мутантни ембриони в сравнение с WT (фиг. 5AA, BB и S1E-H).Взети заедно, тези резултати подкрепят нашите in vitro резултати в SPECC1L-kd U2OS клетки и предполагат, че анормалното AJ оцветяване предхожда CNCC стратификацията в нашите мутантни ембриони.
Като се има предвид известната антагонистична връзка между активността на AKT и стабилността на E-cadherin, 17, 28 предположихме участието на PI3K-AKT сигнализиране.В допълнение, ние наблюдавахме субепидермални мехури в някои от нашите мутантни ембриони, които избегнаха смъртност (<5%) при E9.5-10.5 и вместо това се установиха на около E13.5 (фиг. S3).Субепидермалните везикули са отличителен белег на намалено PI3K-AKT сигнализиране на базата на PDGFRα12.Fantauzzo и др.(2014) съобщават, че нарушаването на базираното на PDGFRα PI3K активиране в PdgfraPI3K/PI3K мутантни ембриони води до субепидермални везикули, дефекти на невралната тръба и фенотипове на цепнато небце.Наистина, нивата на пан-AKT и активно фосфорилиран Ser473-AKT бяха намалени in vivo в Speccll мутантни тъкани до E9.5 ембрионален арест (Фиг. 6A-D).Намаляването на нивата на фосфорилиран Ser473-AKT може да се дължи изцяло на намаляването на нивата на pan-AKT in vivo (ФИГ. 6E) и in vitro (ФИГ. 6F).Намаляване in vitro се наблюдава само когато U2OS клетките са силно конфлуентни с промени в клетъчната форма и плътността на AJ (Фигура 6D).По този начин нашите данни предполагат, че SPECC1L е нов положителен регулатор на PI3K-AKT сигнализиране в краниофациалната морфогенеза.
(A–E) E8.5 (A, B) и E9.5 (C, D) срезове на черепа или E9.5 лизати от Specc1l мутантни ембриони (E), показващи нива на активно фосфорилирано S473-AKT и пан-AKT намаляване на протеина , в сравнение с контролния WT.Уестърн блотинг се извършва върху лизати от див тип и мутантни лизати при същите условия.Показаните изображения за SPECC1L са взети от едно петно.Същото петно ​​беше отстранено и повторно изследвано с анти-pan-ACT и β-актин антитела.Нивата на Pan-AKT в E8.5 невронни гънки (A, B) и нивата на фосфорилиран S473-AKT в E9.5 черепни секции бяха значително намалени.(F) Нивата на Pan-AKT бяха аналогично намалени в лизатите на SPECC1L-kd U2OS клетки, събрани при високо сливане.Лентите за грешки представляват SEM от три независими количествени определения на Western blot.(GJ) Секции на WT ембриони при E9.5, оцветени съответно с KI67 и разцепена каспаза 3, показващи клетъчна пролиферация (G, G') и слаба апоптотична активност (H, H').Specc11 мутантните ембриони показват сравнима клетъчна пролиферация (I), но броят на клетките, подложени на апоптоза, е значително увеличен (J).
След това изследвахме маркери за пролиферация и апоптоза.Не наблюдавахме никаква разлика в пролиферацията на ембриони E9.5 (фиг. 6E, G в сравнение с I) с индекс на пролиферация от 82,5% за WT мутанти и 86,5% за Specc1l мутанти, измерени чрез оцветяване с KI67 (p <0,56, Fisher's точен тест).По същия начин, ние не наблюдавахме никаква разлика в апоптозата, измерена чрез оцветяване за разцепена каспаза 3 в неврални гънки при E8.5 до спиране на ембриона (не е показано) (не е показано).За разлика от това, апоптозата е значително повишена при всички E9.5 мутантни ембриони (фиг. 6F, H и J).Това общо увеличение на апоптозата е в съответствие с намаленото PI3K-AKT сигнализиране и ранната ембрионална смъртност 29, 30, 31.
След това, за да потвърдим причинно-следствената роля за PI3K-AKT сигнализирането в AJ промените в нашите kd клетки, ние химически променихме пътя в контролните и kd клетки (Фигура 7A-F).Използвахме като маркер фенотипа на промяна на клетъчната форма, наблюдаван в конфлуентни SPECC1L-kd клетки, които количествено определихме, използвайки съотношението на най-дългия размер (дължина) към съответния вертикален размер (ширина).Очаква се съотношение 1 за относително кръгли или кубовидни клетки (Фигура 7G).В допълнение към формата на клетката, ние също потвърдихме ефекта върху AJ чрез оцветяване с β-катенин (фиг. 7A'-F').Инхибирането на PI3K-AKT пътя с помощта на вортманин е достатъчно, за да промени формата на клетката в контролните клетки (Фигура 7A,C) и AJ (Фигура 7A').PI3K-AKT активаторът SC-79 не повлиява формата на клетката (ФИГ. 7А, Е) или разширяването на AJ (ФИГ. 7А') в контролните клетки.В клетките SPECC1L-kd по-нататъшното потискане на пътя на PI3K-AKT доведе до повишена апоптоза (Фиг. 7B, D) и значително увеличение на оцветяването с β-катенин (Фиг. 7B'), в съответствие с нашите in vivo тежки мутанти.Важно е, че активирането на пътя PI3K-AKT значително подобри клетъчната форма (Фигура 7B, F) и AJ фенотипове (Фигура 7B”).Промените във формата на клетката се определят количествено като съотношение на закръгленост на клетката (CCR) и се сравняват за значимост, както е описано по-горе (ФИГ. 7G).Наистина, в контролните клетки (Фиг. 7G, CCR = 1.56), третирането с вортманин е достатъчно, за да промени значително формата на клетката (Фиг. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) до степен, подобна на наблюдаваната в SPECC1L.-kd клетки (фиг. 7G, CCR = 3.46).Третирането с вортманин на SPECC1L-kd клетки (Фигура 7G, CCR = 3.60, незначително) не е по-значимо от нетретираните kd клетки (Фигура 7G, CCR = 3.46, незначително) или третирани с вортманин контролни клетки (Фигура 7G)., CCR = 3,46, незначителен) допълнително влияе на клетъчното удължаване (7G, CCR = 3,61, незначителен).Най-важното е, че SC-79 AKT активаторът възстановява удължения фенотип на SPECC1L-kd клетки (фиг. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Тези резултати потвърждават, че SPECC1L регулира сигнализирането на PI3K-AKT и предполагат, че умерено намаляване на SPECC1L засяга клетъчната адхезия, докато силното намаление води до апоптоза (фиг. 8).
(A–F') Контролни (A, C, E) и SPECC1L-kd (B, D, F) клетки, третирани с инхибитор на пътя на PI3K-AKT вортманин (C, D) или SC-79 активатор (E, F) Лечение Нетретираните контролни клетки са кубовидни (A) с нормално β-cat клетъчно оцветяване (A'), докато kd клетките са удължени (B) с повишено β-cat оцветяване (B').След потискане на пътя на PI3K-AKT, контролните клетки се удължиха (C) с β-cat експанзия (C'), докато kd клетките започнаха да претърпяват апоптоза (D), подобно на нашите силно мутирали ембриони и показващи изключително подобрена β-cat.оцветяване (D').След активиране на пътя PI3K-AKT контролните клетки остават кубовидни (E) и имат нормално β-cat (E') оцветяване, докато kd клетките показват значително подобрена клетъчна форма (F) и β-cat (F') оцветяване, което показва, че (G) Степента на промяна на формата на клетката в (AF) беше количествено определена с помощта на съотношението на закръгленост на клетката (CCR) на най-дългия размер (дължина) и съответния вертикален размер (ширина) с помощта на софтуера MetaMorph.Нетретираните (NT) SPECC1L-kd клетки (CCR = 3.46) са значително по-дълги от контролните клетки (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Инхибирането на Wort на PI3K-AKT пътя в контролните клетки е достатъчно, за да причини подобно удължаване на клетъчната форма (CCR=3.61, p<2.4×10-9).По подобен начин, AKT активирането от SC-79 в SPECC1L-kd клетки възстановява клетъчното удължаване до контролни нива (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).Третирането с вортманин на SPECC1L-kd клетки доведе до повишена апоптоза, но без по-нататъшно увеличаване на промяната на клетъчната форма (CCR=3,60) в сравнение с нетретираните kd (CCR=3,46, ns) или третирани с вортманин контролни клетки (3,61), наблюдавани при .ns = няма значение.Показани са +/- SEM измервания за 50 клетки.Статистическите разлики бяха изчислени с помощта на t-тест на Student.
(A) Схематично представяне на инхибирането и активирането на пътя на PI3K-AKT, което води до промени в AJ и съответно спасяване.(B) Предложен модел за стабилизиране на AKT протеин от SPECC1L.
Премиграционните CNCC изискват лизис на AJ, за да се отдели от невроепителни клетки на предната неврална гънка1,15,32.Повишеното оцветяване на AJ компонентите и загубата на апикално-базалното AJ асиметрично разпределение в SPECC1L-дефицитни клетки както in vitro, така и in vivo, комбинирани с физическата близост на SPECC1L до β-катенин, предполагат, че SPECC1L функционира, за да поддържа правилно локалната стабилност на AJ за организационни мускули.актинов цитоскелет.Асоциацията на SPECC1L с актиновия цитоскелет и β-катенин и увеличаването на броя на кондензираните актинови нишки в отсъствието на SPECC1L е в съответствие с наблюдаваното увеличение на плътността на AJ.Друга възможност е, че увеличеният брой актинови влакна в клетки с дефицит на SPECC1L води до промяна в междуклетъчното напрежение.Тъй като клетъчният стрес засяга динамиката на AJ 33, промените в напрежението могат да доведат до по-дифузен AJ 34 .Така че всички промени ще засегнат слоевете CNCC.
Wnt1 се експресира в ранните неврални гънки, които пораждат клетки на нервния гребен.По този начин проследяването на линията на Wnt1-cre маркира както преди, така и мигриращия NCC35.Въпреки това, Wnt1 също маркира клонове на дорзална мозъчна тъкан, също получени от ранни неврални гънки 35, 36, което прави вероятно нашето оцветяване на E9.5 мутанти за Wnt1 маркери в отворени неврални гънки да не е CNCC.Нашето положително оцветяване за NCC маркерите AP2A и SOX10 потвърди, че откритите неврални гънки на Specc11 мутантни ембриони наистина съдържат CNCC.В допълнение, тъй като AP2A и SOX10 са маркери за ранна миграция на NCC, положителното оцветяване показва, че тези клетки са пост-миграционни CNCC, които не могат да бъдат стратифицирани от E9.5.
Нашите данни предполагат, че молекулярната регулация на AJ от SPECC1L се медиира от PI3K-AKT сигнализиране.AKT сигнализирането е намалено в клетки и тъкани с дефицит на SPECC1L.Констатациите на Fantauzzo et al.поддържат пряка роля за PI3K-AKT сигнализиране в краниофациалната морфогенеза.(2014) показаха, че липсата на активиране на PI3K-AKT сигнализиране, базирано на PDGFRα, води до фенотип на цепнато небце.Ние също така показваме, че инхибирането на PI3K-AKT пътя е достатъчно, за да промени AJ и клетъчната форма в U2OS клетки.В съответствие с нашите открития, Cain et al.37 показа, че понижаването на PI3K α110 субединицата в ендотелните клетки води до подобно увеличение на перицелуларното оцветяване с β-катенин, наречено увеличение на „индекса на свързаност“.Въпреки това, в ендотелните клетки, чиито актинови нишки вече са силно организирани, потискането на PI3K-AKT пътя води до рехава форма на клетката.Обратно, клетките SPECC1L-kd U2OS показват удължена клетъчна форма.Тази разлика може да е специфична за типа клетка.Докато потискането на PI3K-AKT сигнализирането трайно засяга актиновия цитоскелет, ефектът върху формата на клетката се определя от промени в напрежението, причинени от промени в плътността и организацията на централните актинови влакна.В U2OS клетки използвахме само промени във формата на клетката като маркер за промяна и възстановяване на AJ с дефицит на SPECC1L.В заключение, ние предполагаме, че инхибирането на пътя на AKT при дефицит на SPECC1L повишава стабилността на AJ и намалява деламинацията в CNCC.
Интересното е, че пан-AKT нивата са намалени in vitro и in vivo в допълнение към фосфорилираните 473-AKT нива в отсъствието на SPECC1L, което предполага регулиране на PI3K-AKT сигнализиране на нивото на AKT протеинова стабилност или оборот.Гените SPECC1L и MID1, и двата свързани със синдрома на Opitz/GBBB, кодират протеини, които стабилизират микротубулите 18,22.Механизмът, чрез който SPECC1L и MID1 медиират стабилизирането на микротубулите, не е напълно разбран.В случая на SPECC1L, тази стабилизация включва засилено ацетилиране на подгрупа от микротубули 18.Възможно е SPECC1L да използва подобен механизъм за стабилизиране на други протеини като AKT.Показано е, че ацетилирането на лизиновите остатъци в AKT протеина води до намаляване на мембранната локализация и фосфорилиране38.В допълнение, убиквитинирането на веригата K63 при същия лизинов остатък на AKT е необходимо за неговата мембранна локализация и активиране 39, 40.Сред няколко фактора, взаимодействащи със SPECC1L протеини, идентифицирани в различни двухибридни екрани с висока производителност на дрожди, четири – CCDC841, ECM2942, APC и UBE2I43 – са замесени в оборота или стабилността на протеина чрез убиквитиниране или сумоилиране.SPECC1L може да участва в пост-транслационна модификация на AKT лизинови остатъци, засягайки стабилността на AKT.Въпреки това, критичната роля на SPECC1L в локализирането и стабилността на AKT протеина остава да бъде изяснена.
Тежките дефекти в експресията на SPECC1L in vivo водят до повишено оцветяване на AJ маркер и дефектно наслагване на CNCC, както и повишена апоптоза и ранна ембрионална смъртност.Предишни доклади показват, че миши мутанти с повишени нива на апоптоза са свързани с дефекти на невралната тръба 44, 45, 46, 47 и краниофациални дефекти 48.Предполага се, че прекомерната клетъчна смърт в невралните гънки или фарингеалните дъги може да доведе до недостатъчен брой клетки, необходими за правилното морфогенетично движение 48,49,50.За разлика от това, нашите клетъчни линии с дефицит на SPECC1L с умерено намалена експресия на SPECC1L показват само промени в AJ без доказателства за повишена клетъчна смърт.Въпреки това, химическото инхибиране на PI3K-AKT пътя в тези Kd клетки наистина доведе до повишена апоптоза.По този начин, умерено намаляване на експресията или функцията на SPECC1L осигурява оцеляване на клетките.Това е в съответствие с наблюдението, че редки Specc11 мутантни ембриони, които избягват арест в st.E9.5 - вероятно поради намалена ефективност на улавяне на гени - са в състояние да затворят нервните си тръби и да спрат по-късно в развитието си, често с краниофациални дефекти (фиг. S3).Също така в съответствие с това е рядката поява на хетерозиготни Specc1l ембриони с краниофациални аномалии - вероятно поради повишена ефективност на улавяне на гени - както и находката при риба зебра, при която един от двата SPECC1L ортолога (specc1lb) причинява късни ембрионални фенотипове, включително загуба на долни челюсти и двустранни цепки51.По този начин, хетерозиготни SPECC1L мутации на загуба на функция, идентифицирани при хора, могат да причинят малки увреждания във функцията на SPECC1L по време на краниофациалната морфогенеза, достатъчни, за да обяснят техните орофациални цепнатини.Базираната на SPECC1L регулация на междуклетъчните контакти може също да играе роля в палатогенезата и сливането на фарингеалните дъги.Допълнителни проучвания на функцията SPECC1L ще помогнат да се изясни ролята на временните междуклетъчни контакти в CNCC по време на затваряне на невралната тръба в подвижността на невроепителни клетки и краниофациалната морфогенеза.
U2OS контрол на остеосаркома и SPECC1L-kd клетки са описани по-рано (Saadi et al., 2011).Антителата срещу SPECC1L също са били характеризирани по-рано (Saadi et al., 2011).Анти-β-катенин антитела (заек; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (мишка; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), миозин IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), МО)), Е-кадхерин (1:1000; Abkam, Кеймбридж, Масачузетс), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Литълтън, Колорадо), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан Диего , Калифорния), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), разцепена каспаза 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) и β-актин (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) се използва, както е описано..Актиновите нишки бяха оцветени с Acti-stain родамин фалоидин (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS контролни клетки и SPECC1L-kd клетки бяха култивирани в стандартен високо глюкозен DMEM, допълнен с 10% фетален говежди серум (Life Technologies, Carlsbad, СА).За промени в AJ, 2 х 105 клетки се посяват върху стъкло, обработено с 0,1% свински желатин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и се наблюдават за промени във формата на клетката.Клетките бяха събрани в различни посочени времеви точки: 4 часа след посяване (t = 1), 24 часа след посяване (t = 2), сливане без промяна във формата на клетката (t = 3), промяна на формата на клетката (t = 4) , 24 часа след промяната на формата на клетката (t = 5) и 48 часа след промяната на формата на клетката (t = 6) (фиг. 1, 2, 3).За модулиране на PI3K-AKT пътя, клетките се култивират при посочените концентрации с PI3K-AKT инхибитор вортманин (TOCRIS Biosciences, Минеаполис, Минесота) или SC-79 активатор (TOCRIS Biosciences, Минеаполис Адамс, Минесота).Средата, съдържаща химикалите, се сменя ежедневно.
Записите кадър по кадър бяха направени на живи контролни и KD клетки при нормални условия на култура и изображения с фазов контраст бяха събрани на всеки 10 минути в продължение на 7 дни.Изображенията бяха получени с помощта на компютърно контролиран Leica DM IRB обърнат микроскоп, оборудван с механичен етап и 10 × N-PLAN обектив, свързан към QImaging Retiga-SRV камера.По време на изобразяването клетъчните култури се поддържат при 37°C във влажна атмосфера с 5% CO2.
Две генни капани ES клетъчни линии DTM096 и RRH048 от Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) бяха използвани за генериране на Specc11 дефицитни миши линии, обозначени като Specc1lgtDTM096 и Specc1lgtRRH046.Накратко, 129/REJ ES клетки бяха инжектирани в C57BL6 бластоцисти.Получените химерни мъжки мишки бяха развъждани с женски C57BL6 мишки, за да се идентифицира потомство с оцветяване на козината агути.Наличието на векторни вмъквания на генни капани се използва за идентифициране на хетерозиготи.Мишките се държат на смесен фон от 129/REJ; C57BL6.Местоположението на мястото на вмъкване на вектора за генетичен капан беше потвърдено чрез RT-PCR, геномно секвениране и генетично допълване (допълнителна фигура 1).За да се проследи CNCC линията на двойно хетерозиготни Specc1lGT мишки, ROSAmTmG (#007576) и Wnt1-Cre (#003829) мишки (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) бяха кръстосани за получаване на ROSAmTmG и Wnt1-Cre алел в Specc1l мутантни ембриони.Всички експерименти с мишки бяха извършени съгласно протоколи, одобрени от Комитета за грижа и използване на животните на медицинския център на Университета в Канзас.
Ембрионите се фиксират в (1% формалдехид, 0.2% глутаралдехид, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) за 60 минути при стайна температура.След фиксиране в разтвор за оцветяване с X-gal (5 mM калиев ферицианид, 5 mM калиев фероцианид, 2 mM MgCl2, 0,01% натриев дезоксихолат, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Оцветяването се извършва при 37°C .°C в рамките на 1-6 часа.Ембрионите бяха постфиксирани в 4% PFA и визуализирани.
За Western blotting, клетките бяха лизирани в пасивен лизисен буфер (Promega, Fitchburg, WI), допълнен със смес от HALT протеазни инхибитори (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Лизатите бяха обработени върху 12% полиакриламид Mini-PROTEAN TGX готови гелове (Bio-Rad, Hercules, CA) и прехвърлени към Immobilon PVDF мембрани (EMD Millipore, Billerica, MA).Мембраните бяха блокирани в 5% мляко в PBS, съдържащ 0.1% Tween.Антителата се инкубират една нощ при 4°С или един час при стайна температура.За генериране на сигнал беше използван реагент Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).За имунооцветяване ембрионите се фиксират за една нощ в 4% PFA/PBS и се криоконсервират.Тъканните криосекции се блокират в PBS, съдържащ 1% нормален кози серум (Thermo Scientific, Waltham, MA) и 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и след това се инкубират при 4°C в инкубатор по време на нощ.с анти-антитяло и флуоресцентно вторично антитяло (1:1000) за 1 час при 4°C.Оцветените срезове се поставят в златна среда ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) и се получават плоски изображения с помощта на конфокален микроскоп Leica TCS SPE.Всяко имунооцветяване се извършва като три независими експеримента върху циросекции на най-малко два мутантни ембриона.Показан е представителен експеримент.
Клетките се инкубират в модифициран RIPA буфер (20 mM Tris-HCl, рН 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% глицерол, 2 mM EDTA и HALT протеазен инхибитор (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Накратко, лизатите се пречистват предварително с магнитни зърна на протеин G (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и след това се инкубират за една нощ при 4° С с анти-SPECC1L или IgG протеин G протеинови зърна се използват за екстрахиране на SPECC1L и се извършва Western blotting с помощта на анти -β-катенин антитяло, описано по-горе. Показаните co-IP експерименти са представителни за четири независими експеримента.
Фиксирани култивирани клетки или миши ембрионални тъкани бяха предоставени на центъра за електронна микроскопия в Медицинския център на Университета в Канзас.Накратко, пробите се вграждат в смола EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), полимеризират се за една нощ при 60°C и се разделят при 80 nm с помощта на ултрамикротом Leica UC7, оборудван с диамантено острие.Секциите се визуализират с помощта на трансмисионен електронен микроскоп JEOL JEM-1400, оборудван с пистолет Lab6 от 100 kV.
Как да цитирам тази статия: Wilson, NR et al.Дефицитът на SPECC1L води до повишена стабилност на сплайсираните стави и намалено разслояване на клетките на черепния нервен гребен.науката.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Индукция и диференциация на нервния гребен.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR и др.Клетките на черепния нервен гребен в движение: тяхната роля в краниофациалното развитие.Американски журнал за медицинска генетика.Част A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: неговият растеж и развитие в продължение на 20 години.педиатър.патология.лаборатория.лекарство.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU и Noten MM Пробив в генетиката на орофациалните цепнатини.Тенденции в молекулярната медицина 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. и Riley, FM Молекулярни механизми на миграция и моделиране на клетките на черепния нервен гребен по време на краниофациалното развитие.Развитие 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксън, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH и Murray, JK Цепка на устната и небцето: разбиране на генетични и екологични влияния.естествен коментар.Генетика 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Анормална морфогенеза на кожата, крайниците и краниофациалната област при мишки с дефицит на интерферон-регулиращ фактор-6 (Irf6).Национален Женет.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Доминиращите мутации в GRHL3 причиняват синдром на van der Waord и нарушават развитието на оралната перидерма.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ и Juriloff, DM Актуализиране на списъка на миши мутанти с дефекти в затварянето на невралната тръба и напредък към пълно генетично разбиране на затварянето на невралната тръба.Изследване на вродени дефекти.Част A, Клинична и молекулярна тератология 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-медиирано PDGFRalpha сигнализиране регулира оцеляването и пролиферацията в развитието на скелета чрез p53-зависим вътреклетъчен път.Генно развитие 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND и Murdoch, JN Disheveled: Връзка на конвергентното разширение със затварянето на невралната тръба.Тенденции в неврологията.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).